高糖對人血管內皮祖細胞增殖的影響及其機制的初步研究.pdf

1、糖尿病是臨床常見的代謝性疾病，而血管病變則是其慢性并發(fā)癥的主要表現，為糖尿病患者預后和生活質量的重要影響因素。多項研究表明，存在缺血性血管形成受損的糖尿病患者伴有視網膜的血管新生，即糖尿病視網膜病變(DR)。DR中的新生血管由于其功能不完善，從而引起玻璃體反復出血、纖維增生、視網膜脫離，最終發(fā)展為視力喪失。近年的研究發(fā)現，DR的新生血管與體內的某種干細胞密切相關.即內皮前體細胞(endothelial progenitor cells，

2、EPCs)，又稱為內皮祖細胞，是近年發(fā)現的能自我更新、增殖分化為內皮細胞的多能干細胞與血管新生關系密切。大量的證據表明EPCs在血管形成中起重要作用，尤其在缺血條件下，Grant等研究發(fā)現骨髓來源的EPCs在成人視網膜血管新生的模型中起重要作用。有實驗表明，NO也與糖尿病關系密切，糖尿病外周血中EPCs細胞數量減少可能與NO的減少有關，然而在DR中NO和EPCs與新生血管間的作用尚未見報道。本實驗觀察高濃度葡萄糖體外培養(yǎng)EPCs，旨在了

3、解高糖與EPC增殖的關系及NO在其中的作用機制。 我們從臍血成功分離出單核細胞，體外應EPCs專用培養(yǎng)基EGM-2MV培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài)，免疫熒光染色鑒定細胞表面標志CD133、KDR、vWF的表達。體外培養(yǎng)的P2代細胞隨機分為4組，即正常對照組：用EGM-2MV培養(yǎng)液培養(yǎng)；高糖組：葡萄糖終濃度為33mmol/L的EGM-2MV培養(yǎng)液；高糖+L-NAME組：含葡萄糖濃度33mmol/L的EGM-2MV培養(yǎng)液中加入

4、內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase，eNOS)抑制劑L-NAME10μmol/L；甘露醇組(滲透壓對照組)：含甘露醇的終濃度為33mmol/L的EGM-2MV培養(yǎng)液。四組細胞各培養(yǎng)48小時，采用倒置顯微鏡觀察細胞生長形態(tài)，用CCK-8試劑分析細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期，采用免疫熒光染色研究3-硝基酪氨酸(3-NT)蛋白表達的變化。 結論：(1)通過密度梯度法可成功從人臍血分

5、離出血管內皮前體細胞。(2)高濃度葡萄糖培養(yǎng)EPCs可明顯促進細胞增殖，但卻不影響細胞分化。(3)高糖可使EPC表達3-NT蛋白增多，加入L-NAME后可明顯逆轉高糖對細胞的增殖作用。由此可見，高糖對EPCs的作用機制可能是通過引起細胞釋放NO，從而促進細胞增殖；高糖不影響EPCs分化，即不影響血管形成作用，而只是促進了血管生成，從而生成糖尿病視網膜病變中的新生血管網。通過探究EPCs細胞增殖、分化的機制，研究血管發(fā)生和血管形成，可能為