PI3K-Akt信號(hào)通路下游關(guān)鍵分子對(duì)甲型流感病毒增殖的影響.pdf

1、病毒在感染宿主細(xì)胞后可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來支持自身的高效復(fù)制。甲型流感病毒感染可以激活宿主細(xì)胞的PI3K/Akt通路。但是PI3K/Akt通路在流感病毒感染過程中支持流感病毒有效復(fù)制下游具體機(jī)制并不清楚。為了進(jìn)一步揭示PI3K通路對(duì)流感病毒增殖進(jìn)行調(diào)控的具體分子機(jī)制，本研究立足于PI3K通路下游兩個(gè)主要的生物學(xué)效應(yīng)(細(xì)胞凋亡和翻譯起始的調(diào)節(jié))，探討了PI3K/Akt信號(hào)通路的三個(gè)關(guān)鍵的下游分子mdm2、GSK-3β和mTOR對(duì)流感病

2、毒感染過程的影響。在研究mdm2、GSK-3β和mTOR對(duì)流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用中，本研究主要通過RNA干擾技術(shù)使mdm2、GSK-3β或mTOR基因表達(dá)下調(diào)后，應(yīng)用Caspase Glo3/7凋亡檢測試劑盒和流式細(xì)胞術(shù)檢測了流感感染細(xì)胞凋亡水平的變化，應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測了細(xì)胞活力的改變，并檢測了對(duì)細(xì)胞上清的流感病毒滴度的影響。
　　在mTOR介導(dǎo)的翻譯調(diào)控對(duì)流感病毒感染過程影響的研究中，本研究采用蛋白免疫印記方法

3、檢測了mTOR下游兩個(gè)關(guān)鍵翻譯調(diào)控分子4E-BP1和p70S6K在流感感染細(xì)胞，PI3K抑制劑LY294002或mTOR抑制劑rapamycin處理的流感病毒感染細(xì)胞磷酸化水平的變化。通過NP蛋白間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞液中的病毒滴度等實(shí)驗(yàn)檢測了相應(yīng)的病毒增殖水平。本研究還使用真核表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)甲型流感病毒的NS1蛋白，并檢測了NS1蛋白表達(dá)對(duì)Akt及4E-BP1磷酸化的影響。在對(duì)流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的研究中，本研究發(fā)現(xiàn)：mdm2

4、分子在流感病毒感染過程中發(fā)生了有趣的亞細(xì)胞定位變化；mdm2基因表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)了流感病毒感染的A549細(xì)胞的細(xì)胞活力并降低了流感病毒感染造成的A549細(xì)胞凋亡，同時(shí)提高了細(xì)胞上清中的病毒滴度；GSK-3β基因表達(dá)下調(diào)降低了流感病毒感染的A549細(xì)胞的細(xì)胞活力并且增強(qiáng)了流感病毒感染造成的細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低了細(xì)胞上清中的病毒滴度；mTOR基因表達(dá)下調(diào)降低了流感病毒感染的A549細(xì)胞的細(xì)胞活力并且增強(qiáng)了流感病毒感染造成的細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低了細(xì)胞

5、上清中的病毒滴度。在對(duì)于流感病毒蛋白翻譯控制的研究中，本研究發(fā)現(xiàn)：甲型流感病毒感染激活了PI3K/Akt通路并可以引起4E-BP1的磷酸化；使用LY294002阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路可以同時(shí)阻斷p70S6Kianse和4E-BP1的磷酸化；使用Rapamycin阻斷mToRC1的功能可以阻斷p70S6K的磷酸化而對(duì)4E-BP1的磷酸化并沒有顯著影響，特別是在感染后期；LY294002影響了流感病毒NP蛋白的表達(dá)和出核并降低了流感病

6、毒的滴度，而Rapamycin對(duì)流感病毒NP蛋白的表達(dá)和出核過程沒有明顯影響但是卻降低了流感病毒的滴度；使用質(zhì)粒表達(dá)流感病毒的NS1蛋白可以激活PI3K/Akt通路并磷酸化4E-BP1。以上研究結(jié)果提示甲型流感病毒的NS1蛋白可以通過PI3K/Akt信號(hào)通路磷酸化4E-BP1并可能因此影響了病毒蛋白的翻譯。
　　本研究揭示了mdm2、GSK-3p和mTOR對(duì)甲型流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用以及對(duì)病毒增殖的影響。同時(shí)研究了mTO