核基質結合因子SAFB在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機制.pdf

1、研究背景和目的：
　　 結直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,居胃腸道腫瘤的第二位。因此探討與結直腸癌致病相關的因素,闡明結直腸癌發(fā)病機制,尋找預防和治療的有效途徑,是當前研究的重要方向。
　　 核基質結合結合因子(Scaffold attachment factor B,SAFB)是一種多功能蛋白,位于19號染色體19p13.3。它屬于一個核蛋白家族,定位于核基質中,通過與核基質中DNA和RNA相互作用,影響RNA轉錄

2、后加工,參與發(fā)育、組織重建、細胞應激反應以及細胞增殖和凋亡過程。目前有研究表明SAFB與乳腺癌發(fā)生和預后關系密切,盡管SAFB在乳腺癌中的作用較明確,但在其它腫瘤中未見報道,其在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉移中的作用及分子機制亦尚未闡明。因此,本研究重點探討SAFB基因在結直腸癌增殖、侵襲及轉移過程中的可能作用及分子機制,旨在闡明SAFB在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的主要生物學功能,為結直腸癌的早期診斷、干預和治療及其預后奠定理論基礎。
　　

3、 方法：
　　 1.結直腸癌組織及結直腸癌細胞株中SAFB的表達及臨床意義
　　 運用RT-PCR、Real-time PCR及Western blot方法檢測SAFB基因在8種結直腸癌細胞株及28對配對結直腸癌和正常組織中的mRNA和蛋白表達；應用免疫組化S-P法,檢測283例結直腸癌組織和配對的114例正常結直腸組織以及120例結直腸癌區(qū)域淋巴結轉移癌蛋白的表達。
　　 2.SAFB過表達載體構建及對結直腸癌

4、細胞生物學特性的影響
　　 運用RT-PCR法擴增目的基因SAFB,與空載體pcDNA3.1(一)連接后,在8種結直腸癌細胞株中低表達的細胞株SW480中導入pcDNA3.1(一)/SAFB,Real-timePCR及Western blot鑒定轉染后SAFB基因在細胞中的表達；觀察SAFB基因轉染前后,細胞增殖的變化。
　　 3.SAFB干擾載體的構建及表達沉默對結直腸癌細胞生物學特性的影響
　　 設計SAFB

5、干擾片段,將人SAFB基因RNA干擾雙鏈DNA片段重組到逆轉錄病毒質粒pSUPER Retro中,構建攜帶人SAFB基因RNA干擾的逆轉錄病毒載體pSUPER/shRNA-SAFB,經293FT病毒包裝細胞后,產生重組逆轉錄病毒,感染結直腸癌細胞株,經puromycin篩選穩(wěn)定的細胞克隆,實時熒光定量PCR和Western blot法檢測細胞中SAFB基因mRNA的轉錄水平和蛋白的表達水平。
　　 用含SAFB的特異性干擾片段的

6、逆轉錄病毒感染結直腸癌細胞,用含空載體的病毒做對照。用G418篩選抗性克隆,挑取抗性單克隆,熒光定量PCR和Westernblot鑒定干擾后SAFB基因在細胞中的表達；利用MTT法、平板克隆形成實驗檢測SAFB對細胞體外增殖的影響。
　　 4.SAFB表達異常引起結直腸細胞生物學功能異常的分子機制
　　 通過Real-time PCR及Western blot方法檢測結直腸癌細胞轉染pcDNA3.1(一)/SAFB及pS

7、UPER/shRNA-SAFB后,E-Cadherin、Slug、Snail、MTA、α-cantenin、γ-cantenin、β-cantenin、AKT、P38 MAPK、GSK、p-AKT、p-P38 MAPK、p-GSK等的mRNA和蛋白表達水平的變化。
　　 結果：
　　 1.結直腸癌組織中SAFB蛋白的表達
　　 應用RT-PCR檢測8種結直腸癌細胞株SAFB基因的表達,結果表明SAFB基因在SW6

8、20細胞中表達較高,在DLD-1、SW480-M5、LS174T和HT29中度表達,在SW480、HCT116、colo205表達較低。應用RT-PCR、Real-time PCR及Western blot檢測28對結直腸癌配對組織SAFB在mRNA和蛋白水平的表達,結果表明28對結直腸癌配對組織中SAFB基因在腫瘤組織表達較高,在正常結直腸組織表達較低或不表達,而其表達水平高低與結直腸癌浸潤程度、分化程度及轉移無明顯相關性。
　

9、　 免疫組化結果顯示SAFB在正常結直腸黏膜、癌、遠處轉移癌和淋巴結轉移癌四種類型的組織中表達明顯不同,差異具有顯著性(x2=271.214,P<0.01)。兩兩比較發(fā)現(xiàn),在正常黏膜組織和腫瘤組織中,SAFB蛋白的表達前者顯著低于后者(Z=-4.608,P=0.000),發(fā)生遠處轉移癌組織和淋巴結轉移癌組織SAFB表達與配對的結直腸原發(fā)癌組織無顯著性差異(Z=-0.156,P=0.876;Z=-0.466,P=0.642)。本研究結果

10、提示,SAFB蛋白表達與結直腸癌發(fā)病及腫瘤細胞增殖高度相關,即SAFB表達弱或陰性者結直腸發(fā)生率低,表達強者發(fā)生率高,而與結直腸癌的轉移無明顯相關性。
　　 2.過表達SAFB真核表達載體的構建及轉染SAFB過表達對結直腸癌細胞生物學特性的影響
　　 設計人SAFB特異性引物,提取人正常結直腸上皮組織總RNA,應用RT-PCR方法提取人SAFB cDNA,通過雙酶切,將SAFB克隆至pcDNA3.1(一)質粒,經雙酶切及

11、測序鑒定,確定構建人SAFB基因的真核表達載體pcDNA3.1(一)/SAFB,轉染SW480細胞,用Western Blot技術檢測目的蛋白的表達。
　　 通過MTT法,我們檢測了SAFB對結直腸癌細胞體外增殖能力的影響,與pcDNA3.1(一)/vector細胞相比,pcDNA3.1(一)/SAFB細胞的增殖能力增強,差異具有統(tǒng)計學意義(F=71.944,P<0.01)。
　　 3.通過RNAi技術建立SAFB基因穩(wěn)

12、定沉默的結直腸癌細胞株及對結直腸癌細胞生物學特性的影響
　　 構建了2個SAFB的逆轉錄病毒干擾載體pSUPER/shRNA-SAFB1、pSUPER/shRNA-SAFB2(簡稱S1和S2)及空載體病毒pSUPER retro neo(簡稱PRS),感染HCT116、SW480及SW620細胞,篩選出G418抗性單克隆,熒光定量PCR和Western blot結果發(fā)現(xiàn)含兩種片段干擾載體的干擾效率均較高,以S2為甚,且對SW62

13、0細胞的干擾效率最好,命名為SW620/pSUPER/shRNA-SAFB。
　　 MTT法觀察SAFB基因表達沉默后體外細胞的增殖情況,與SW620/pSUPER細胞相比,SW620/pSUPER/shRNA-SAFB細胞的增殖速度減慢顯著,并且呈時間依賴關系(F=3.361,P<0.01)。平板克隆形成實驗顯示SW620/pSUPER/shRNA-SAFB細胞的活力顯著下降,差異具有統(tǒng)計學意義(F=267.579,P=0.0

14、00)。這些結果均說明SAFB表達水平減低后,結直腸癌細胞體外生長被顯著抑制。
　　 4.SAFB表達異常引起結直腸細胞生物學功能異常的分子機制
　　 1)SAFB對相關鈣粘附蛋白的影響及其與上皮間葉轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)發(fā)生的關系
　　 Western blot顯示,SAFB可以誘導鈣粘附蛋白(E-cadherin)表達缺失。SW480細胞自身E-ca

15、dherin的表達缺如或者檢測不到,但當SAFB表達水平被抑制時,SW480細胞E-cadherin則恢復表達。Slug、Snail、MTA是參與上皮間葉轉化的重要轉錄因子,Western blot結果顯示,在SAFB敲低的兩個克隆中,Slug、Snail、MTA的表達受到抑制；Snail、MTA和Slug與E-cadherin的表達成負相關關系,這與SAFB對二者的調節(jié)也是一致的。
　　 2)SAFB對Catenin家族成員的

16、影響
　　 Western Blot檢測表明,抑制SAFB基因表達對catenin家族的影響不明顯。
　　 3)GSK-3 β磷酸化是SAFB調節(jié)鈣粘附蛋白相關信號通路的重要方式
　　 我們觀察到,抑制SAFB表達使GSK-3 β磷酸化明顯受抑制,p-GSK-3 β表達下調,GSK-3 β表達無明顯改變。
　　 4)SAFB對P38 MAPK相關信號通路的影響
　　 我們觀察到,SAFB敲低P38

17、 MAPK磷酸化明顯受抑制,p-P38 MAPK表達下調,P38 MAPK表達無明顯改變。
　　 5)SAFB對AKT相關信號通路的影響
　　 Western Blot檢測表明,SAFB基因沉默對AKT信號通路的影響不明顯。
　　 結論：
　　 1、SAFB基因與結直腸癌細胞增殖密切相關,提示SAFB基因可能參與結直腸癌的發(fā)生及發(fā)展；
　　 2、SAFB可能參與+它在結直腸癌中的作用,證實SAFB

18、通過誘導E-cadherin表達下調促進結直腸癌細胞上皮間葉轉化；
　　 3、SAFB可能通過激活MAPK信號通路,磷酸化GSK-3 β,激活下游的細胞增殖調節(jié)基因(CyclinDl等),從而促進細胞增殖及轉移；調節(jié)EMT分子標志物的表達,可能促進結直腸癌的轉移。
　　 本研究的創(chuàng)新之處:
　　 1、構建了SAFB過表達和敲低的相關載體,建立了SAFB過表達和敲低的結直腸癌細胞克?。?br>　　 2、發(fā)現(xiàn)SAF