hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的體液免疫效應及其抗生育潛能.pdf

1、目的:構建帶有6個組氨酸(6His)純化標簽的hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的分泌型真核表達質粒,體外穩(wěn)定表達與純化具有生物學活性的hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白.通過融合分子佐劑C3d3,增強hCGβ蛋白抗原在不同品系小鼠的免疫原性,實現(xiàn)hCGβ蛋白疫苗的Th2型體液免疫優(yōu)勢效應,并增強hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗抗血清中和hCG生物學活性的能力.方法:以帶有信號肽的hCGβ為模板,經PCR反應在hCGβ的氨基端

2、加上6個組氨酸(6His)純化標簽,將其構建入高效真核表達載體phCMV1即得phCMV1-6His-hCGβ.將C3d3與hCGβ進行基因融合,并構建入phCMV1即得phCMV1-6His-hCGβ-C3d3.脂質體法介導phCMV1-6His-hCGβ-C3d3、phCMV1-6His-hCGβ、pcDNA3-hCGβ-C3d3和pcDNA3-hCGβ轉染中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,G418(800μg/ml)篩選抗藥性克隆.放射

3、免疫法檢測抗性克隆無血清培液中hCGβ表達量,Western blotting鑒定所表達的重組蛋白,Raji細胞免疫化學染色法鑒定hCGβ是否與C3d分子成功融合.隨后,采用針對于6His的鎳柱結合凝膠過濾層析純化表達產物.分別用hCGβ-C3d3融合蛋白、單用hCGβ蛋白和hCGβ蛋白加用弗氏佐劑免疫生育期雌性BALB/c和C<,57>BL/6小鼠,共免疫兩次,間隔4周.ELISA測定血清中抗hCGβ抗體滴度,比較各組的免疫效果.BA

4、LB/c小鼠于末次免疫后3周處死,制備脾淋巴細胞懸液hCG體外脈沖培養(yǎng)48h,ELISA檢測培養(yǎng)上清中Thl型(IFN<,γ>、IL-2)和Th2型(IL-4、IL-10)細胞因子分泌水平.為檢測hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的抗生育潛能,把hCG分別與正常鼠血清、hCGβ-C3d3免疫鼠血清、hCGβ免疫鼠血清和hCGβ+CFA/IFA免疫鼠血清共培養(yǎng)MLTC-1細胞,化學發(fā)光法檢測培養(yǎng)前及共培養(yǎng)7小時后培養(yǎng)上清中孕酮的含量.此外,選

5、用3周齡雌性BALB/c小鼠,皮下注射hCG的同時分別腹腔內注射系列稀釋的正常鼠血清、hCGβ-C3d3免疫鼠血清、hCGβ免疫鼠血清和hCGβ+CFA/IFA免疫鼠血清,每天2次,共3天.3天后取子宮稱濕重,計算每克體重的子宮濕重(mg/g).結論:成功構建了hCGβ-C3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的真核表達質粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ.在CHO細胞中可成功獲得hCGβ-C3d3融合