Notch信號在巨噬細(xì)胞調(diào)控重度燒傷創(chuàng)面中的作用.pdf

1、重度燒傷急救與治療一直是臨床和實驗研究的重點和難點，傷后免疫功能的紊亂，不但可以促發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS），而且還是多器官功能障礙(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)及患者死亡的主要誘因。巨噬細(xì)胞在整個燒傷炎癥及損傷修復(fù)過程中均有重要的作用，是機體抗感染免疫的最主要效應(yīng)細(xì)胞之一，同時也是機體內(nèi)環(huán)境中免

2、疫細(xì)胞和免疫分子致傷后免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂的重要細(xì)胞。目前關(guān)于調(diào)控巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)來控制傷后機體失控性炎癥反應(yīng)尚存不明確，因此從巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用角度來救治重度燒傷是一個重要的解決思路。
　　Notch分子首次發(fā)現(xiàn)于1917年的摩爾根實驗室，因其突變能夠造成果蠅翅膀邊緣出現(xiàn)小缺口（Notches）而得名。目前已知，Notch分子信號家族成員具有高度的結(jié)構(gòu)同源性及保守性，其受體及配體屬于Ⅰ型膜蛋白，對哺乳動物而言Notch受體有4種

3、（Notch1、Notch2、Notch3和Notch4），表達在多種組織和器官中。Notch配體分為Delta-like(Delta-like1，Delta-like3，Delta-like4)和Jagged(Jagged1，Jagged2)兩類。Notch分子信號通路功能廣泛，可以調(diào)控機體多種免疫細(xì)胞的發(fā)育及功能，而且可以通過多種分子機制調(diào)控單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的激活和功能。因此我們假設(shè)，Notch分子信號通路在重度燒傷后存在表達上的

4、變化并且對機體免疫反應(yīng)應(yīng)答發(fā)揮重要作用，本研究擬探討其作用及分子機制。
　　方法：
　　1.課題實驗研究第一部分建立穩(wěn)定的C57/BL6J小鼠30％體表總面積（Total body surface area，TBSA）Ⅲ度燙傷模型，觀察并評定創(chuàng)面深度，傷后依據(jù)不同時間點檢測創(chuàng)面周圍Notch分子表達量；探討重度燒傷情況下Notch信號變化趨勢。
　　2.課題實驗研究第二部分體外模擬重度燒傷后內(nèi)環(huán)境，培養(yǎng)RAW264.7

5、巨噬細(xì)胞系，經(jīng)不同燒傷血清刺激巨噬細(xì)胞，檢測其Notch信號表達改變；實驗分假傷血清組和燒傷血清組，燒傷血清組可分為燒傷后6h、12h、24h、48h及4d、7d血清組。各組血清與RPMI-1640培養(yǎng)液制成20%的混合培養(yǎng)液，培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，分別于0h、4h、8h、12h、24h、48h收集細(xì)胞樣品，檢測其Notch1分子表達量。
　　3.課題實驗研究第三部分基本探討重度燒傷后巨噬細(xì)胞Notch信號通路激活的分子機制，并研究Not

6、ch信號通路激活后對其分泌功能的影響。使用重度燒傷后24h及7d收集的血清刺激巨噬細(xì)胞，同時用假傷大鼠血清加脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）制成混合培養(yǎng)液刺激巨噬細(xì)胞，比較Notch信號通路變化的異同；另外收集上述各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測巨噬細(xì)胞的分泌功能，ELISA酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6和TNF-α含量。
　　結(jié)果：
　　1.實驗第一部分利用C57/BL6J小鼠建立穩(wěn)定的30%

7、TBSAⅢ度燙傷模型，傷后免疫組化染色結(jié)果顯示：燒傷Ⅲ度12h及24h后Notch1信號表達均明顯高于對照組；而Notch2分子表達量增高不明顯；創(chuàng)周組織蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示：重度燒傷后創(chuàng)周組織中存在Notch1和Notch2分子的表達增高。
　　2.實驗第二部分體外模擬重度燒傷后內(nèi)環(huán)境，培養(yǎng)利用RAW264.7巨噬細(xì)胞系，經(jīng)不同組重度燒傷血清刺激后，各組巨噬細(xì)胞中Notch信號表達量有明顯差異；其結(jié)果顯示：利用早期重度燒傷血清

8、制成混合培養(yǎng)液，培養(yǎng)巨噬細(xì)胞一定時間后，Notch1分子表達量趨勢總體升高，并且隨著刺激時間延長而達到高峰；而采用重度燒傷后期的血清制成混合培養(yǎng)液，培養(yǎng)巨噬細(xì)胞相同時間后，對Notch1信號的激活作用減弱。
　　3.實驗第三部分基本探討重度燒傷后巨噬細(xì)胞Notch信號通路激活的分子機制，并研究Notch1信號通路激活后對其分泌功能的影響；研究結(jié)果表明重度燒傷巨噬細(xì)胞激活途徑與LPS激活Notch信號機制相似，并且燒傷24h血清、假