人結(jié)腸癌相關(guān)基因表達(dá)及甲基化調(diào)控.pdf

1、目的:結(jié)腸癌的發(fā)生同其它腫瘤一樣,有癌基因的過(guò)度表達(dá)和/或抑癌基因的失活.而在基因表達(dá)調(diào)控中,DNA甲基化在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著極其重要的角色.其異常是通過(guò)影響癌基因和抑癌基因的表達(dá)以及基因組的穩(wěn)定性而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的.之前人們主要關(guān)注于結(jié)腸癌發(fā)生過(guò)程中單個(gè)基因的甲基化紊亂情況,而對(duì)于結(jié)腸癌中多個(gè)基因表達(dá)的甲基化調(diào)控情況知之甚少.在人結(jié)腸癌colo-320和SW1116兩種細(xì)胞株中多個(gè)基因的甲基化情況尚未明了.該論文的主要目的

2、是闡明結(jié)腸癌的發(fā)生中多種抑癌基因和癌基因的甲基化情況和細(xì)胞周期進(jìn)程,進(jìn)一步深入探索通過(guò)改變抑癌基因的甲基化而研究結(jié)腸癌治療的新方法的可能性.方法:培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo-320和SW1116兩種細(xì)胞,以5×10<'4>/ml接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于含5﹪CO<,2>、95﹪濕度的37℃CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng).首先用去甲基化制劑(DNAmethyltransferase,DNMT)5-氮脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycyti

3、dine,5-aza-dC)分別以2μM,5μM,10μM的不同濃度干預(yù)24小時(shí)和72小時(shí),用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,2-diphenylietrazolium)檢測(cè)對(duì)照組與干預(yù)組細(xì)胞的生長(zhǎng)活力,以檢測(cè)我們應(yīng)用之濃度的藥物干預(yù)是否會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性.然后分別以2μM、5μM和10μM的不同濃度的5-aza-dC干預(yù)這兩種細(xì)胞24小時(shí)和72小時(shí),在不同的時(shí)間點(diǎn)提取其DNA和RNA,以RT-PCR檢

4、測(cè)p16<'INK4A>、p21<'WAF1>、APC、p<'73>、Survivin、c-Ki-ras和c-myc等多種基因的的mRNA表達(dá)情況;同時(shí)以流式細(xì)胞儀分析Colo-320和SW1116的細(xì)胞周期.為檢測(cè)藥物干預(yù)后的p16<'INK4A>基因的甲基化改變情況,我們采用亞硫酸氫鈉修飾和測(cè)序的方法檢測(cè)p16<'INK4A>基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的情況.設(shè)計(jì)引物中無(wú)CpG二核苷酸.結(jié)論:我們的研究主要結(jié)果表明了人結(jié)腸癌細(xì)胞系Colo-