上調腎小管SnoN蛋白表達改善糖尿病腎病腎纖維化的作用及機制研究.pdf

1、目的：腎小管間質纖維化(renal tubulointerstitial fibrosis，RTIF)是糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN)的主要病理特征，在RTIF進程中腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)發(fā)揮著關鍵作用，但此過程涉及多種分子介質和細胞事件的參與，影響因素眾多，且相互作用復雜，以致至今對其分子機制尚未完全闡明。轉化生長因子

2、-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前公認致纖維化作用最強的細胞因子，主要通過TGF-β1/Smad細胞信號通路誘導和調節(jié)腎小管EMT及RTIF的全過程。核轉錄共抑制因子SnoN(Ski-related novel protein N)是該信號傳導途徑的重要負調控因子，對TGF-β1的生物學效應起負調控作用。本課題組前期研究發(fā)現，在DN發(fā)病過程中SnoN蛋白的減少放大了TGF-β1的致纖

3、維化效應，但SnoN蛋白表達降低在DN腎纖維化發(fā)病中的確切作用和機制尚需要進一步的研究。本實驗旨在以SnoN為研究靶點，以糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）大鼠模型和高糖處理的腎小管上皮細胞（renal tubular epithelial cells，RTECs）為研究對象，分別從蛋白水平、轉錄水平、外源性藥物干預等三個方面，利用siRNA技術敲低RTECs中E3泛素連接酶Arkadia表達、慢病毒穩(wěn)定轉染體系使RTE

4、Cs過表達SnoN、體內和體外OM干預等方法，結合腎小管EMT和纖維化等相關指標的檢測。進一步明確SnoN表達變化與腎小管EMT和RTIF的關系，探討上調腎小管SnoN表達在改善DN腎間質纖維化發(fā)病中的作用及其可能機制，為有效防治DN提供理論和實驗依據。
　　方法：1.（1）動物實驗：雄性SD大鼠隨機分為正常對照（NC）組和DM組。以尾靜脈注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）復制DM大鼠模型，48小時（h）后測空

5、腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L且尿糖陽性者判斷造模成功。NC組大鼠尾靜脈注射STZ溶媒。各組大鼠均予標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)至16周（W）處死。生化法測血糖（BG）、血肌酐（Scr）、尿蛋白（UP），記錄24h尿量計算24h尿蛋白量（24hUP）；HE（hematoxylin and eosin）和Masson染色后顯微鏡下觀察腎組織病理變化；免疫組化法檢測E-鈣粘素（E-cadherin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smoot

6、h muscle actin，α-SMA）和纖維連接蛋白（fibronectin，FN）在腎小管的分布和表達；Western blot和實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real-time fluorescent quantitative Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）分別檢測TGF-β1、SnoN、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN的蛋白和mRNA表達。（2）細胞實驗：體外培養(yǎng)的正常大

7、鼠近端腎小管上皮細胞株(NRK52E)隨機分組，①正常糖（NG）組：2％ FBS+ DMEM+5.5mmol/L Glucose，②高糖(HG)組：2% FBS+ DMEM+25mmol/L Glucose，各組分別設2h、12h、24h、48h和72h五個培養(yǎng)時間點；應用免疫熒光染色（Immunofluorescence staining，IF）檢測各組細胞中E-cadherin、α-SMA表達變化，Western blot和qRT-

8、PCR分別檢測各組細胞中TGF-β1、SnoN、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN的蛋白和mRNA表達。2.采用siRNA干擾技術敲低正常人近端腎小管上皮細胞(HK-2)中Arkadia的表達，高糖條件下培養(yǎng)48h后，qRT-PCR法檢測各組細胞SnoN和Arkadia的mRNA表達；Western blot法檢測各組細胞SnoN、Arkadia、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA等的蛋白表達；酶聯(lián)免疫吸

9、附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測培養(yǎng)液中的FN蛋白量。3.利用慢病毒穩(wěn)定轉染體系使HK-2細胞中SnoN過表達，高糖條件下培養(yǎng)48h后，Western blot法檢測各組細胞SnoN、Arkadia、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA等的蛋白表達；qRT-PCR法檢測各組細胞SnoN和Arkadia的mRNA表達；ELISA法檢測培養(yǎng)液中的FN蛋白量。4. OM干預

10、處理，（1）動物實驗：雄性SD大鼠隨機分為NC組、DM組和OM治療組。STZ復制DM大鼠模型，48h后測空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L且尿糖陽性者判斷造模成功。NC組大鼠尾靜脈注射STZ溶媒，OM治療組自DM大鼠造模成功次日起，予以75mg//kg/d OM灌胃處理。各組大鼠均給予標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水，大鼠飼養(yǎng)至16 W處死。生化法測BG、Scr、UP，記錄24 h尿量計算24hUP；HE和Masson染色后顯微鏡下觀察腎組織

11、病理變化；免疫組化法檢測E-cadherin、α-SMA、FN在腎小管的分布和表達；Western blot和qRT-PCR分別檢測TGF-β1、SnoN、Smad7、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN的蛋白和mRNA表達。（2）細胞實驗一：NRK52E細胞分組①NG組，②HG組，③HG+不同濃度OM（0.01、0.05、0.10、0.25、0.50mg/ml）組，培養(yǎng)48h。利用免疫熒光染色-激光共聚焦顯微鏡（IF

12、-LSCM）檢測E-cadherin和α-SMA的表達強度、Western blot、qRT-PCR方法檢測SnoN、Smad7、TGF-β1、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN的蛋白和mRNA表達。細胞實驗二：①NG組，②HG組，③HG+0.50mg/ml OM動態(tài)觀察(HM)組，分別設2h、12h、24h、48h和72h五個培養(yǎng)時間點進行動態(tài)觀察，利用Western blot、qRT-PCR方法檢測SnoN、Sm

13、ad7、TGF-β1、Arkadia、E-cadherin、α-SMA、FN蛋白和mRNA表達。
　　結果：1.（1）動物實驗：與NC組相比，DM組大鼠BG、Scr、24hUP顯著增高，伴明顯腎纖維化病變，E-cadherin蛋白表達顯著降低，α-SMA、FN蛋白表達顯著增高；TGF-β1、Arkadia蛋白和mRNA表達顯著增高；SnoN蛋白水平顯著降低，而mRNA水平顯著增高。（2）細胞實驗：與NG組相比，HG組NRK52E細

14、胞隨高糖刺激時間延長，TGF-β1、Arkadia、α-SMA、FN蛋白和mRNA表達進行性增高，E-cadherin mRNA和蛋白表達進行性降低，呈時間依賴性；SnoN蛋白表達進行性降低，而SnoN mRNA表達進行性增高。2. siRNA敲低正常人近端腎小管細胞（HK-2）的Arkadia后高糖處理48h，與空白細胞組相比，Arkadia mRNA和蛋白水平顯著降低，SnoN和E-cadherin表達顯著增高，α-SMA和FN表達

15、顯著降低，TGF-β1表達無顯著差異。3.過表達SnoN的HK-2細胞高糖處理48h后，與空白細胞組相比，SnoN mRNA和蛋白水平均顯著增高，E-cadherin表達顯著增高，α-SMA和FN蛋白顯著降低，Arkadia和TGF-β1表達均無顯著差異。4. OM干預效果（1）動物實驗：與DM組相比，OM治療組BG無明顯差異，Scr、24hUP明顯降低，纖維化病變有所改善，TGF-β1、Arkadia、α-SMA、FN表達明顯降低，S

16、noN、Smad7、E-cadherin表達明顯增高。（2）細胞實驗一：①激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現，作用48h，與NG組相比，HG組E-cadherin表達明顯減弱，α-SMA表達明顯增強；與HG組相比，HG+OM不同濃度組隨OM劑量下降，E-cadherin表達逐漸減弱，α-SMA表達逐漸增強；與HG組各相應時間點NRE52E細胞相比，HG+0.50mg/ml OM組TGF-β1、Arkadia、α-SMA、FN mRNA和蛋白顯著降

17、低，Smad7和SnoN蛋白顯著增高，E-cadherin mRNA和蛋白顯著增高，而Smad7和SnoN mRNA水平無明顯差異。②Western blot、qRT-PCR結果顯示，與HG組相比，HG+OM不同濃度組隨OM劑量增加，TGF-β1、Arkadia、α-SMA、FN蛋白和mRNA表達均逐漸降低，E-cadherin蛋白和mRNA表達逐漸增高，SnoN和Smad7蛋白表達逐漸增高，呈劑量依賴性，而SnoN和Smad7 mRN

18、A表達無明顯差異。
　　結論：1.高糖通過促進腎小管上皮細胞中Arkadia表達增高，增強對SnoN蛋白泛素化降解水平而下調SnoN蛋白表達，即腎小管上皮細胞中SnoN的表達受Arkadia調控；2.敲低腎小管上皮細胞中Arkadia mRNA表達，使SnoN蛋白表達上調，對高糖誘導的腎小管EMT有抑制作用；3.過表達腎小管上皮細胞中SnoN可抑制高糖誘導的腎小管EMT；4. OM通過抑制Arkadia表達而上調SnoN蛋白表達，