受體相互作用蛋白3在大鼠急性高眼壓視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中表達變化的初步研究.pdf

1、目的:研究受體相互作用蛋白3(Receptor Interacting Protein3，RIP3)在正常大鼠視網(wǎng)膜中的分布以及急性眼高壓早期大鼠視網(wǎng)膜RIP3表達的時空變化，初步探討急性高眼壓早期導(dǎo)致視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞損傷的可能分子機制。
　　 方法:(1)隨機挑選6只健康的成年Sprague-Dawley大鼠，3只活取視網(wǎng)膜組織勻漿后進行免疫蛋白印跡法檢驗抗體特異性，3只灌注取材之后冰凍切片進行抗體吸收實驗和免疫組織化學(xué)染色以及R

2、IP3與Neuron-specifc nuclear antigen(NeuN，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志物)、Calbindin(CB，水平細(xì)胞標(biāo)志物)、Glial fibrillary acidic protein(GFAP,星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)、Glutamine synthetase(GS，Müller細(xì)胞標(biāo)志物)、Protein kinase C alpha(PKC-α，雙極細(xì)胞標(biāo)志物)、Parvalbumin(PV，無長突細(xì)胞標(biāo)志物)、

3、Rhodopsin(視細(xì)胞標(biāo)志物)、Synaptophysin(突觸標(biāo)志物)、Integrin，alpha M(CD11b，小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)染色，分析RIP3在正常成年大鼠視網(wǎng)膜不同細(xì)胞類型中的表達分布;(2)挑選18只健康的成年Sprague-Dawley大鼠按照存活時間隨機分為6小時、12小時、24小時三個組，每組6只。一側(cè)眼球進行加壓處理、另一側(cè)眼球作為自體對照，不作任何處理。高眼壓側(cè)眼球在眼前房插針加壓，維

4、持壓力至110毫米汞柱1小時，下架存活至相對應(yīng)的時間點后，每個小組隨機取3只大鼠注射過量的麻藥后冰上快速剝離視網(wǎng)膜組織，免疫蛋白印跡法分析RIP3的表達量。每組另外3只大鼠灌注取材用免疫熒光染色分析RIP3在視網(wǎng)膜中的表達變化。
　　 結(jié)果:1.RIP3在正常成年大鼠視網(wǎng)膜中的免疫組織化學(xué)染色顯示:神經(jīng)纖維層和節(jié)細(xì)胞層染色最強，內(nèi)核層染色強度較弱可見顆粒狀細(xì)胞形態(tài)，內(nèi)網(wǎng)層染色強度最弱，在外網(wǎng)層邊緣部分可見少量染色較淺的RIP3陽

5、性細(xì)胞分布，外網(wǎng)層未見明顯陽性細(xì)胞染色，染色強度較弱;2.免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)染色顯示:在節(jié)細(xì)胞層，RIP3的陽性產(chǎn)物與NeuN陽性產(chǎn)物存在明顯雙標(biāo);在內(nèi)核層靠近內(nèi)網(wǎng)層邊緣部分與部分PV陽性產(chǎn)物存在明顯雙標(biāo);在內(nèi)核層靠近外網(wǎng)層邊緣部分與部分CB陽性產(chǎn)物存在明顯雙標(biāo)，此外，RIP3與PKC-α，GS陽性產(chǎn)物，GFAP陽性產(chǎn)物以及CD11b陽性產(chǎn)物呈現(xiàn)微弱的雙標(biāo);3.在急性高眼壓處理以后，Western blot顯示RIP3表達明顯增強，表

6、現(xiàn)為6小時、12小時的條帶明顯增粗，24小時條帶較12小時弱;免疫熒光染色顯示:急性高眼壓損傷后，損傷組與正常對照組相比RIP3陽性染色分布未見明顯變化，節(jié)細(xì)胞層的RIP3陽性染色明顯較對照組強，其中12小時染色最強，6小時和24小時的染色強度較空白對照組有所增強，但較12小時染色弱。
　　 結(jié)論:RIP3主要分布于視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞，并在部分無長突細(xì)胞和水平細(xì)胞以及膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達，而在其他類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞未見明顯表達。急性高眼壓早期