高遷移率族蛋白B1在失血性休克所致急性肺損傷中的作用.pdf

1、目的：復(fù)制失血性休克致急性肺損傷(acute lung injury,ALI)動(dòng)物模型。探討高遷移率族蛋白B1(high mobility group box1 protein,HMGB1)在失血性休克所致ALI中的作用。 方法：①動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：雄性BALB/c小鼠42只,8-12周齡,體重28+3g,隨機(jī)分成對(duì)照組、失血性休克致ALⅠ組(分4h、16h、24h、48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn))和抗-HMGB1抗體干預(yù)組(分別為抗-HMGB1 抗

2、體干預(yù)4h和干預(yù)24h組)。對(duì)照組小鼠心臟穿刺不抽血。失血性休克組小鼠通過(guò)心臟穿刺抽血,在1分鐘左右抽30％循環(huán)血量造成失血性休克,靜置1小時(shí)后預(yù)實(shí)驗(yàn)提示成功復(fù)制失血性休克致ALI模型,分別于造模后4h、16h、24h、48h活殺小鼠,活殺前1小時(shí)經(jīng)尾靜脈注射伊文蘭(Evens blue dye,EBD),右心室注射PBS緩沖液沖洗肺血管,留取肺組織標(biāo)本行下一步檢測(cè)。失血性休克后1小時(shí),小鼠腹腔注射單克隆鼠抗-MGB1抗體(200ug/

3、小鼠)?？?HMGB1抗體干預(yù)4h組于注射抗體后4h活殺小鼠留取肺組織檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)。抗-HMGB1抗體干預(yù)24h組注射抗體23h后于小鼠尾靜脈注射EBD50mg/kg(5mg/ml,200ul),1小時(shí)后活殺小鼠測(cè)肺組織EBD量。②標(biāo)本檢測(cè)：應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)肺組織HMGB1含量；ELISA方法檢測(cè)肺組織白介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)和腫瘤

4、壞死因子(tumor necrosis factor alpha,TNFa)含量：MPO試劑盒檢測(cè)肺組織MPO：肺組織烘干,分光光度法測(cè)EBD。 結(jié)果：①模型動(dòng)物肺組織病理學(xué)檢查：光鏡下失血性休克致ALⅠ組小鼠肺組織標(biāo)本在ALI 4h可見(jiàn)肺泡間隔增厚,肺泡腔變窄,肺泡間質(zhì)水腫,肺泡腔內(nèi)有水腫液形成,肺組織點(diǎn)片狀出血,血管中見(jiàn)多形核粒細(xì)胞附壁,紅細(xì)胞聚集,微血栓形成,肺泡腔亦可見(jiàn)多形核粒細(xì)胞。ALI 16h組肺組織彌漫性炎癥改變較

5、4h組明顯,以24h組肺組織急性彌漫性病變最重,并持續(xù)至48h組?？?HMGB1抗體干預(yù)組小鼠肺組織也可見(jiàn)肺泡間質(zhì)水腫增厚,肺泡內(nèi)見(jiàn)水腫液及多形核粒細(xì)胞,但程度較對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)ALⅠ組減輕。②肺組織IL-1β和TNFa檢測(cè)結(jié)果：與對(duì)照組(IL-1β 284.83±30.49pg/ml;TNFα584.17±181.17pg/ml)相比,失血性休克致ALI 4h肺組織IL-1β(333.83±31.18pg/ml)和TNFα(776.67±1

6、03.67pg/ml)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其后肺組織IL-1β和TNFα水平降至正常。③肺組織MPO檢測(cè)結(jié)果：失血性休克致ALI 4h達(dá)高峰(38.33±3.88U/g肺組織),其后逐漸下降,持續(xù)至48h(9.66±2.16U/g肺組織)仍高于對(duì)照組(8.00±0.89U/g肺組織),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);抗-HMGB1抗體干預(yù)4h組肺組織MPO水平(25.67±1.63U/g肺組織)與失血性休克致ALI

7、 4h組(38.33±3.88U/g肺組織)相比顯著降低,但仍高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。④肺組織EBD檢測(cè)結(jié)果：失血性休克致ALⅠ組四個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察肺組織EBD均顯著高于對(duì)照組(4.634±0.43g/ml/g肺組織),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),峰值在ALI 24h(20.05±2.79g/ml/g肺組織)?？?HMGB1抗體干預(yù)24h組肺組織EBD水平(5.68±0.53g/ml/g肺組織)與失血性休克致AL

8、I 24h組相比顯著降低,但仍高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。⑤肺組織HMGB1檢測(cè)結(jié)果：肺組織HMGB1水平在ALI 16h開(kāi)始升高(HMGB1/β-actin 0.99±0.16),至ALI 24h達(dá)高峰(HMGB1/β-actin 1.00±0.32),并持續(xù)至ALI 48h(HMGB1/β-actin 0.90±0.27),與對(duì)照組(HMGB1/β-actin 0.50±0.18)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05

9、)。 結(jié)論：①在失血性休克誘發(fā)的ALI中,HMGB1在肺組織中的表達(dá)增高。肺組織HMGB1水平在休克后16小時(shí)左右升高,持續(xù)至24h左右達(dá)到高峰,并持續(xù)至48h。②在失血性休克誘發(fā)的ALI中,肺組織IL-1β和TNFα在ALI 4h左右有所增高,其后降至正常。③抗-HMGB1抗體干預(yù)組肺組織MPO及EBD值與ALⅠ組相比顯著降低。以上結(jié)果提示:HMGB1是失血性休克誘發(fā)的急性肺損傷的晚期炎癥介質(zhì),與肺泡中性粒細(xì)胞積聚及肺水腫的進(jìn)