6-姜酚對過氧化氫致HUVEC損傷的保護作用及機制探討.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 6-姜酚通過自噬對過氧化氫致HUVEC凋亡的保護作用
　　目的:動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展是一種多因素參與的復雜病理生理學過程。凋亡是誘發(fā)心血管細胞損傷的重要原因之一，多種可以引起動脈粥樣硬化的致病因素均可激活血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡。在近期的研究中，關于自噬與凋亡在心臟疾病中的相互關系，以及自噬所起的調(diào)節(jié)作用受到很大關注。自噬在心血管功能及形態(tài)的維持中起著非常重要的作用，研究自噬在血

2、管內(nèi)皮細胞損傷中的作用，可以為動脈粥樣硬化治療提供新思路。很多植物化學物可以誘導自噬的發(fā)生，6-姜酚作為一種植物化學物具有抗動脈粥樣硬化的作用，但具體的機制尚不完全清楚，本研究著重探討自噬是否在6-姜酚抗動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮重要作用。
　　方法:以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)為研究對象，應用不同濃度的6-姜酚(10-40μM)預處理24小時后，再與H2

3、O2(800μM)共同作用1小時。用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT)檢測不同劑量的6-姜酚和H2O2作用后，HUVEC存活率的變化，同時應用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和自噬誘導劑雷帕霉素(rapamycin)預處理，檢測6-姜酚和H2O2作用后，HUVEC存活率的變化;用Hoechst33342熒光染色和annexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡;用熒光顯微鏡觀察經(jīng)過Cy

4、to-ID(R) Green染色的自噬體的變化;用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測細胞內(nèi)自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ，自噬相關蛋白Bcl-2、Beclin-1、mTOR、p-mTOR表達量的變化;用激光共聚焦顯微鏡觀察HUVEC溶酶體穩(wěn)定性的變化;用熒光分光光度計檢測細胞內(nèi)活性氧類(ROS)的含量變化，還原性谷胱甘肽(GSH)水平的改變，線粒體膜電位的變化，同時應用自噬抑制劑3-MA和自噬誘導劑雷帕霉素預處理，檢測6-姜酚和

5、H2O2作用后，HUVEC內(nèi)ROS和GSH水平的變化。
　　結(jié)果:(1)凋亡的結(jié)果:H2O2(800μM)作用1小時后，應用Hoechst33342染色，熒光顯微鏡下可見胞核濃染，濃縮或碎裂的凋亡細胞。用6-姜酚(10-40μM)預處理后，鏡下可見凋亡細胞數(shù)明顯下降，熒光分布區(qū)域減少，呈明顯的量效關系;annexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測HUVEC凋亡的結(jié)果表明:與對照組相比，H2O2處理組凋亡細胞明顯的增多(P＜0

6、.01)，經(jīng)6-姜酚保護后，各劑量組的細胞凋亡的數(shù)目明顯減少，并呈明確的量效關系(P＜0.01)。(2)自噬的結(jié)果:經(jīng)過Cyto-ID(R)Green染色后，熒光顯微鏡觀察對照組和H2O2處理組綠色點狀熒光較少，而6-姜酚保護組中，自噬體所發(fā)出明亮綠色熒光物質(zhì)逐漸增多;Western blot結(jié)果顯示自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ表達隨6-姜酚濃度增加而增加，呈明顯的量效關系(P＜0.01);(3)自噬相關蛋白表達的結(jié)果:Western bl

7、ot結(jié)果顯示對照組與H2O2處理組未見到明顯的Bcl-2，Beclin-1，及p-mTOR蛋白的表達。而6-姜酚保護組中，隨6-姜酚濃度增加，Bcl-2,Beclin-1蛋白的表達量逐漸增加，而p-mTOR蛋白表達逐漸減少(P＜0.01)。(4)氧化應激指標結(jié)果:熒光分光光度計檢測結(jié)果顯示H2O2處理組中ROS水平顯著上升，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，而6-姜酚保護組巾，隨6-姜酚濃度增加，ROS水平顯著降低(P＜0.05

8、或P＜0.01);H2O2處理組中GSH水平顯著下降(P＜0.01)，而6-姜酚保護組中，隨6-姜酚濃度增加，GSH水平顯著提高（P＜0.05或P＜0.01）。應用自噬抑制劑3-MA預處理后，ROS水平顯著升高，GSH水平顯著降低，與未加3-MA組比較，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01);加入雷帕霉素(100nmol/L)預處理后，細胞內(nèi)的ROS水平顯著降低，GSH水平顯著升高，與未加雷帕霉素組比較，其差異具有統(tǒng)計學意義

9、(P＜0.05或P＜0.01)。(5)溶酶體線粒體結(jié)果:熒光分光光度計檢測結(jié)果顯示H2O2處理后，線粒體膜電位水平顯著下降(P＜0.01)，用6-姜酚預處理后，可升高HUVEC線粒體的膜電位水平(P＜0.05或P＜0.01);激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，H2O2處理組，AO熒光強度較弱(P＜0.01)，提示細胞溶酶體穩(wěn)定性降低，而對照組和6-姜酚預處理組，AO熒光強度較強，提示6-姜酚可以提高細胞溶酶體的穩(wěn)定性(P＜0.05或P＜0.01

10、)。
　　結(jié)論:1、H2O2(800μM)作用于HUVEC1小時后可引起細胞發(fā)生凋亡，6-姜酚(10-40μM)預處理24小時后可抑制凋亡的發(fā)生。2、6-姜酚作用于HUVEC可引起細胞自噬的發(fā)生。3、自噬相關蛋白Bcl-2，Beclm-1蛋白表達增加，p-mTOR蛋白表達減少，提示自噬的發(fā)生可能與mTOR信號通路和Beclin1復合物有關。4、氧化應激的結(jié)果顯示，H2O2處理后，ROS水平升高，GSH水平下降，6-姜酚預處理后可降

11、低ROS水平，升高GSH水平，推測自噬有潛在的抗氧化應激的作用。5、6-姜酚作用后可使HUVEC溶酶體穩(wěn)定性增加，線粒體的膜電位水平升高，從而抑制凋亡的發(fā)生。
　　第二部分 6-姜酚對過氧化氫致人臍靜脈內(nèi)皮細胞DNA損傷的保護作用
　　目的:冠心病的發(fā)病機制涉及多種因素，其中血管內(nèi)皮細胞損傷是心血管疾病發(fā)生的始動因素。大量實驗證明血管內(nèi)皮細胞DNA損傷與動脈粥樣硬化密切相關，活性氧是導致DNA損傷的直接原因之一，當活性氧的產(chǎn)

12、生與細胞抗氧化能力失衡時就會造成氧化應激(oxidative stress)，引起活性氧增加，通過復雜機制導致DNA損傷。本研究的目的是檢測6-姜酚作為一種抗氧化劑，能否保護過氧化氫致HUVEC的DNA損傷，并探討其可能的機制。
　　方法:以人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC為研究對象，用H2O2作為誘導劑，建立DNA損傷模型。應用不同濃度的6-姜酚(10-40μM)預處理24小時后，再與H2O2(50μM)共同作用1小時。用單細胞凝膠電

13、泳（彗星實驗）檢測細胞DNA損傷情況;用熒光分光光度計檢測細胞內(nèi)ROS的含量變化，GSH水平的改變，線粒體膜電位的變化，溶酶體膜穩(wěn)定性的改變;用Western blot法檢測細胞內(nèi)p53蛋白的表達量的變化。所用試驗應用N-乙酰半胱氨酸(NAC，10 mM)作為陽性對照。
　　結(jié)果:(1) DNA損傷結(jié)果:H2O2(50μM)作用于HUVEC1小時后，引起DNA鏈斷裂，細胞形成彗星樣拖尾現(xiàn)象，尾長、尾部DNA/頭部DNA(％)及尾矩

14、明顯大于對照組(P＜0.01)。用6-姜酚(10，20，40μM)處理HUVEC24小時，然后與H2O2組溫育1小時，SCGE試驗各項指標明顯減輕(P＜0.05或P＜0.01)。(2)氧化應激指標結(jié)果:用2'，7'-二氫二氯熒光素(DCFH)和苯二醛(OPT)分別測定細胞內(nèi)ROS以及GSH水平，結(jié)果顯示，H2O2作用于HUVEC1小時后，細胞內(nèi)ROS水平顯著上升，GSH水平顯著下降，用6-姜酚預處理后，可顯著降低細胞內(nèi)ROS水平，顯著升

15、高GSH水平。與對照組相比有統(tǒng)計學意義，并呈明顯的量效關系(P＜0.05或P＜0.01)。(3)溶酶體線粒體結(jié)果:H2O2(50μM)作用于HUVEC1小時，細胞內(nèi)溶酶體膜的穩(wěn)定性顯著降低(P＜0.01）。HUVEC經(jīng)6-姜酚預處理24小時后，再與H2O2溫育1小時，細胞內(nèi)溶酶體膜的穩(wěn)定性顯著高于H2O2組(P＜0.05或P＜0.01)。將H2O2(50μM)作用于HUVEC1小時，細胞內(nèi)線粒體膜電位顯著降低(P＜0.01)。經(jīng)10μM

16、-40μM濃度的6-姜酚處理24小時后，再與H2O2作用1小時，可見細胞內(nèi)熒光強度明顯增高，細胞內(nèi)線粒體膜電位升高，并呈劑量依賴關系(P＜0.05或P＜0.01)。(4) p53蛋白表達的結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示H2O2(50μM)組p53蛋白表達明顯，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。6-姜酚(40μM)預處理24小時后，再與H2O2共同作用1小時，細胞內(nèi)p53蛋白表達水平明顯下降，與單獨H2O2組相比有顯著性差

17、異（P＜0.01）。NAC陽性對照組，p53蛋白表達水平較低，與單獨H2O2組相比有顯著性差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論:1、H2O2(50μM)作用于HUVEC1小時后可引起細胞發(fā)生DNA損傷，6-姜酚(10-40μM)預處理24小時后可抑制DNA損傷的發(fā)生。2、H2O2(50μM)可引起HUVEC內(nèi)ROS生成增加，細胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)GSH耗竭，使細胞處于氧化應激狀態(tài)，6-姜酚可減少H2O2引起HUVEC內(nèi)ROS水平的升高，并使