骨髓間充質干細胞和傘狀支撐骨移植術治療股骨頭壞死的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 股骨頭壞死(Osteonecrosis of the Femoral Head，ONFH)是由于多種病因破壞股骨頭血供使骨的活性成分(包括骨細胞、骨髓造血細胞和脂肪細胞)死亡的一種病理過程。該病發(fā)病率高，若未經有效治療，約80％的患者將在1～4年內發(fā)生股骨頭塌陷，關節(jié)功能毀壞，最終不得不接受人工全髖關節(jié)置換。但由于該病多發(fā)于中青年，且多為雙側關節(jié)同時受累，中青年實行人工關節(jié)置換術后遠期療效尚不理想。所以股骨頭壞死的

2、治療目標除了改善臨床癥狀外，更重要的是防止股骨頭塌陷，延緩病變發(fā)展，盡量保留患者自身的股骨頭，推遲甚至避免人工關節(jié)置換術。保留股骨頭的理想治療方法是既能有效改善股骨頭的血液供應，加強壞死骨的修復，又能恢復股骨頭的生物力學性能，防止塌陷。目前臨床上尚無達到上述要求的理想方法。本研究將骨髓間充質干細胞和傘狀支撐骨植入山羊股骨頭壞死模型，通過影像學、組織學和生物力學檢查觀察其修復過程，探索一種新的治療股骨頭壞死的方法。
　　 本研究分

3、為三個部分。
　　 方法：
　　 第一部分：改良的液氮冷凍法建立山羊股骨頭壞死模型。12只健康1周歲中國青山羊均采用改良的液氮冷凍法隨機側別建立單側股骨頭壞死模型，采取髖關節(jié)后側入路，不脫位髖關節(jié)，不切開關節(jié)囊，自關節(jié)囊邊緣向股骨頭負重區(qū)方向鉆孔，用棉簽蘸取液氮涂抹于孔內冷凍。分別于造模術后2天、2周、4周、8周分批處死(每批3只)行放射學、組織學觀察。
　　 第二部分：山羊骨髓間充質干細胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定。

4、取健康1周歲中國青山羊，髂骨穿刺抽取髂骨骨髓，采用密度梯度離心法分離骨髓間充質干細胞，結合貼壁篩選法進行培養(yǎng)。觀察細胞形態(tài)及生長情況，測定細胞成活率及傳代細胞貼壁率，對第2，4，6代細胞采用連續(xù)計數法繪制出生長曲線，計算細胞倍增時間，免疫細胞化學染色法鑒定細胞表面抗原標志。
　　 第三部分：骨髓間充質干細胞和傘狀支撐骨移植術治療股骨頭壞死的實驗研究。44只健康1周歲中國青山羊全部用改良的液氮冷凍法隨機側別制作單側股骨頭壞死模型。

5、造模8周后，隨機挑選2只處死，行放射學、組織學檢查檢測造模情況。余42只隨機分為A、B、C三組(每組14只)，于模型側分組施術。A組為骨髓間充質干細胞和傘狀支撐骨移植術組。采取髖關節(jié)后側入路進入，鑿取帶股方肌蒂骨柱，同時在取骨柱處鑿取4～6根帶皮質骨的小骨柱，清除股骨頭內死骨后取已制備好的山羊自身的骨髓間充質干細胞懸液混合于小部分松質骨植于股骨頭軟骨下，并于股骨頭內的前、后、內、外多方向植入4～6根小骨柱，中間植入帶股方肌蒂骨柱(大骨柱

6、)，周圍空腔用松質骨填充壓實，使這些骨柱支撐類似撐開的傘狀；B組為單純股方肌骨柱移植術組；C組為骨髓間充質干細胞和松質骨移植術組。徹底清除壞死骨，在壞死側股骨頭內先植入其自身的骨髓間充質干細胞，但是不植骨柱，僅為打壓植入松質骨。三組的健側均作為自身正常對照。分別于術后3、6個月行放射學、組織學檢查及生物力學測定。
　　 結果：
　　 第一部分術后2天，股骨頭出現骨細胞壞死，X線檢查模型側可見低密度針道影；術后2周可見骨髓

7、纖維化，骨小梁周圍骨髓基質細胞增多，X線顯示針道影模糊，模型側股骨頭無明顯骨壞死改變；4周時可見修復反應出現，X線顯示股骨頭負重區(qū)出現囊性變，周圍骨質硬化；8周時模型側股骨頭骨小梁變細、稀疏、斷裂、排列紊亂，骨細胞變性死亡，可見大量空骨陷窩，軟骨表面毛糙，部分脫落，軟骨下骨壞死區(qū)可見增生結締組織，X線顯示模型側股骨頭骨密度不均，負重區(qū)軟骨面輕度塌陷。各組正常側股骨頭均無異常變化。
　　 第二部分骨髓間充質干細胞原代細胞呈“滿天星

8、”樣分布，圓形，大小均勻，周圍有少量血細胞。培養(yǎng)24h后部分細胞貼壁，呈橢圓形。48 h后更多細胞貼壁，呈梭形、多角形。4～6d后形成細胞集落，隨培養(yǎng)進行細胞集落逐漸增多，12～14d長滿瓶底80％，即可行細胞傳代。傳代后4h細胞貼壁，1—6代細胞12h貼壁率大于90％，24h貼壁率可達100％。6～8d長滿瓶底，細胞融合率可達100％，1—6代細胞成活率均大于95％。傳代細胞呈均一長梭形，細胞膜及細胞核清晰，細胞密度較高時呈放射狀、漩

9、渦狀排列。第2代骨髓間充質干細胞免疫組化染色，細胞表面抗原CD29，CD44呈陽性表達(胞漿呈黃褐色染色)，CD34，CD45呈陰性表達。生長曲線呈S型，1～2d為潛伏期；2～3d后進入對數增長期；6～7d后進入平臺期。第2，4，6代細胞倍增時間分別為25．61h，27．89h，28．66h，平均倍增時間為(27．38±2．03)h。
　　 第三部分治療術后3個月：(1)X線檢查：A組、B組手術側股骨頭外形恢復，囊性低密度區(qū)消失

10、，原塌陷已修復，股骨頭無再塌陷。A組植骨愈合良好，骨柱影己模糊；B組植骨愈合欠佳，骨柱影仍較清晰；C組手術側骨修復效果明顯較A組、B組差，股骨頭輪廓不規(guī)則，扁平塌陷，密度不均。(2)組織學觀察：A組骨小梁成熟，排列規(guī)則；B組骨小梁幼稚，排列不規(guī)則；C組骨小梁變細、稀疏、斷裂。①3組手術側和正常側股骨頭骨小梁面積分數百分比分別為：(40．18±2．71和41．90±2．52)、(36．21±2．46和41．56±2．35)、(31．42±

11、2．74和41．90±2．48)％。A組骨小梁面積分數百分比高于B組、C組(P<0．05)，與正常側比較差異無統(tǒng)計學意義(p>0．05)。②3組手術側和正常側空骨陷窩計數百分比分別為：(12．01±1．53和11．53±1．32)、(18．35±1．51和11．68±1．21)、(22．23±1．12和11．47±1．26)％。A組空骨陷窩計數百分比低于B組、C組(P<0．05)，與正常側比較差異無統(tǒng)計學意義(p>0．05)。(3)生物

12、力學檢測：3組手術側和正常側股骨頭軟骨下骨最大壓縮強度和平均彈性模量分別為：(77．43±2．65和120．60±4．18)、(64．43±1．55和84．85±2．31)、(42．10±1．25和54．72±2．09)MPa，(82．61±2．02和127．37±4．74)、(83．09±1．23和126．36±1．39)、(83．91±1．32和126．85±2．88)MPa。3組手術側和正常側股骨頭松質骨的最大壓縮強度和平均彈性模

13、量分別為：(46．63±1．32和81．74±3．96)、(39．48±0．75和63．78±1．27)、(30．83±0．73和45．90±2．34)MPa，(48．75±0．72和87．77±2．01)、(48．65±0．83和86．42±1．39)、(48．78±0．72和87．34±1．61)MPa。A組手術側股骨頭軟骨下骨、松質骨的最大壓縮強度和平均彈性模量高于B組、C組(p<0．05)，與正常側比較差異無統(tǒng)計學意義(p>0．

14、05)。治療術后6個月：X線檢查A組、B組手術側股骨頭已為正常股骨頭X線表現，而C組手術側股骨頭已完全塌陷。組織學檢查A組、B組手術側股骨頭空骨陷窩計數百分比、骨小梁面積分數百分比與正常側比較差異已無統(tǒng)計學意義(P>0．05)，且A、B組差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0．05)。生物力學測試顯示A組、B組手術側股骨頭軟骨下骨、松質骨的最大壓縮強度和平均彈性模量與正常側比較差異無統(tǒng)計學意義(p>0．05)，且A、B組差異亦無統(tǒng)計學意義(p>0．

15、05)
　　 結論：
　　 第一部分采用改良的液氮冷凍法可以制作出股骨頭壞死伴關節(jié)面輕度塌陷的動物模型。該造模方法動物死亡率低，壞死成功率高，操作簡單，創(chuàng)傷較小，可重復性大，不破壞關節(jié)面及髖關節(jié)的穩(wěn)定性，適合模擬臨床上開窗減壓植骨治療股骨頭壞死的實驗研究。
　　 第二部分應用密度梯度離心法結合貼壁培養(yǎng)法獲得的山羊骨髓間充質干細胞純度較高，生長狀態(tài)良好。通過免疫細胞化學染色法鑒定細胞表面抗原標志，結合細胞生物學特性