RNAi沉默整合素鏈接激酶基因?qū)σ认侔㏄ANC-1細胞增殖的影響及其作用機制的研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學研究生學位論文獨創(chuàng)性聲明本人申明所呈交的學位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果也不包含為獲得我校或其他教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料’與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請學位論文與資料若有不實之處，本人承擔一切相關(guān)責任。論文作者簽名：壹【皇日期：do／o多，譬中國醫(yī)

2、科大學研究生學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解中國醫(yī)科大學有關(guān)保護知識產(chǎn)權(quán)的規(guī)定即：研究生在攻讀學位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬中國醫(yī)科大尊本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時署名單位為中國醫(yī)科大學，且導(dǎo)師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國醫(yī)科大學。學校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤允許論文被查閱和借閱。學?？梢怨紝W位論文的全部或部分內(nèi)容(保密內(nèi)容除外)，以采用影印、縮印或其他手段保存論文。中文論著

3、摘要RNAi沉默整合素鏈接激酶基因?qū)σ认侔㏄ANC1細胞增殖的影響及其作用機制的研究目的構(gòu)建整合素鏈接激酶(ILK)基因RNA干擾(RNAinterference，RNAi)表達載體，研究其對胰腺癌PANC1細胞ILK基因表達的抑制作用及其對胰腺癌細胞增殖的影響。為研究胰腺癌的發(fā)病機制與治療提供理論依據(jù)。方法設(shè)計三對針對ILK基因的小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)序列，并根據(jù)該序列合成兩條小發(fā)央RNA(

4、smallhairpinRNA，shRNA)的DNA模板單鏈，同時模板鏈兩端分別設(shè)計不同的兩個限制性酶切位點。退火形成siRNA載體插入片斷。用限制性內(nèi)切酶將siRNA空載體線性化，T4連接酶將插入片斷插入siRNA空質(zhì)粒中。經(jīng)PCR和測序的方法鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。通過陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000將重組質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人胰腺癌細胞株P(guān)anc1細胞中，G418篩選4周后以綠色熒光蛋白(GFP)基因為報告基因，

5、用熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒表達效率。挑選陽性單克隆繼續(xù)在G418壓力下擴大培養(yǎng)4周后，再以GFP基因為報告基因，用流式細胞儀和熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒表達效率。應(yīng)用半定量RTPCR方法，檢測胰腺癌PANC1細胞中ILKmRNA表達水平，應(yīng)用WesternBlot方法，檢測胰腺癌PANC1細胞中ILK基因蛋白表達水平。篩選出干擾效率最高的重組質(zhì)粒。M玎筅黔：每組約2000細胞接種96孔細胞培養(yǎng)板上，在37℃、5％C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別與Oh、24