脫落滋養(yǎng)細胞用于孕早期快速產前診斷的研究.pdf

1、第一部分:
　　 目的：比較孕早期經過宮頸獲取滋養(yǎng)細胞的幾種方法，探討適宜的取材方法，并檢驗其方法應用的敏感性和可靠性。
　　 方法：選取早孕并要求終止妊娠的60名早孕婦女（孕6周～孕10周），在其知情同意后，分別采用3種方法經宮頸采集脫落細胞，隨機分為三組，每組各20例：A組采用宮頸管棉拭子法，B組采用宮頸內口粘液吸引法，C組采用細胞刷法。選取20名未孕的婦女，在其知情同意后，行宮腔灌洗法采集的宮頸脫落細胞懸液作為對照

2、組（D組）。收集后的宮頸脫落細胞的標本，行HE染色及免疫細胞化學染色，然后顯微鏡觀察滋養(yǎng)細胞的存在情況，并計數細胞。免疫細胞化學染色選用的單克隆抗體細胞角蛋白-7（CK-7），與滋養(yǎng)細胞上的抗原發(fā)生特異性反應，觀察陽性表達的細胞并計數。
　　 結果：1.HE染色法：A組、B組、C組3種方法得到的標本中分別有8例（40％）、11例（55％）、18例（90％）標本中見滋養(yǎng)細胞。對照組的標本中均未見滋養(yǎng)細胞。A組的滋養(yǎng)細胞獲得率與B組

3、比較差異無統計學意義（p>0.05），C組的滋養(yǎng)細胞獲得率較A組和B組高，差異有統計學意義（p<0.01，p<0.01）。2.免疫細胞化學染色法：A組、B組、C組3種方法得到的標本中分別有2例（10％）、5例（25％）、18例（90％）標本中見陽性表達的細胞。對照組的標本中均未見陽性細胞。A組的滋養(yǎng)細胞獲得率與B組比較差異無統計學意義（p>0.05），C組的滋養(yǎng)細胞獲得率較A組和B組高，差異有統計學意義（p<0.01，p<0.01）。3

4、.三種方法采集滋養(yǎng)細胞的數量的比較：(1)HE法：3種方法中細胞刷法取得的細胞量最多，分別與宮頸管棉拭子組和宮頸內口粘液吸引組比較，其差異有統計學意義（p=0.002，p=0.002）。而宮頸管棉拭子組采集的細胞的量與宮頸內口粘液吸引組相比，其差異無統計學意義（p=0.605）。(2)免疫細胞化學染色法：三種方法中細胞刷法取得的細胞量最多。宮頸管棉拭子組中見陽性細胞的例數太少，無法進行比較。細胞刷法取得的滋養(yǎng)細胞量多于粘液吸引組，比較后

5、其差異有統計學意義（p=0.000）。4.采集標本中滋養(yǎng)細胞的量與采集標本的孕周有一定的關系，本實驗中，孕6周未采集到滋養(yǎng)細胞，從孕7周到孕10周隨著孕周增加采集的標本中獲得的滋養(yǎng)細胞數量增多（r=0.548，p=0.005）。5.滋養(yǎng)細胞的陽性率與孕婦的妊娠次數及標本的血污程度有一定關系（p=0.033，p=0.048），與孕婦的年齡和分娩次數無相關性（p=0.122,p=0.228）。
　　 結論：1.從早孕婦女宮頸管獲取滋

6、養(yǎng)細胞是可行的。2.經宮頸細胞刷法取得的細胞量較多，成功率高。所以認為細胞刷法是一種較好的微創(chuàng)取材方法。3.孕7周之后經宮頸獲取滋養(yǎng)細胞的成功率較高，細胞量較多。
　　 第二部分:
　　 目的：研究熒光原位雜交（FISH）技術在快速產前診斷胎兒染色體數目的應用，探討其對宮頸脫落細胞在產前遺傳學診斷中的臨床應用價值：通過比較兩組的實驗結果、吻合度和差異性，分析FISH技術在染色體數目檢測中的快速性和準確性，并分析和常規(guī)染色

7、體核型分析的優(yōu)缺點。
　　 方法：（1）分組：采集的脫落細胞經過富集和純化后行FISH檢測，作為實驗組；并同時取對應孕婦的絨毛組織作為對照組，行常規(guī)的染色體核型分析。（2）滋養(yǎng)細胞純化和富集：選取早孕并要求終止妊娠的20名婦女（孕8周～孕10周），應用前一部分的取材方法中較好的細胞刷法無菌取得的實驗組樣本，在排除精液污染后，經過相應處理去除粘液等步驟后，行差速貼壁法培養(yǎng)后收獲細胞，盡可能的純化和富集細胞。（3）滋養(yǎng)細胞的鑒定：取

8、出一部分用細胞角蛋白-7（CK-7）行免疫細胞化學染色進行鑒定，并計數細胞量。（4）用FISH技術進行檢測：FISH組的樣本經過預處理、樣本變性、探針變性、雜交及其后處理、熒光顯微鏡觀察等程序。（5）常規(guī)染色體核型分析：對宮頸脫落細胞所對應的孕婦，人工流產時無菌操作獲取絨毛，經過絨毛組織細胞培養(yǎng)的方法，染色體核型分析等步驟得到最后的結果。
　　 結果：（1）細胞刷法所取的20例樣本經過4天的培養(yǎng)后，培養(yǎng)成功的例數為18例（90％

9、）。培養(yǎng)過的細胞在行免疫細胞化學染色鑒定后行細胞計數，細胞達到103個/ml-104個/ml。從培養(yǎng)成功的標本中取10例行FISH檢測，結果顯示標本和探針雜交良好，鏡下觀察見背景暗，熒光信號明亮清晰，10例均雜交成功。顯示男胎7例，女胎3例，13、18和21號染色體的數目均正常。對照組中相對應的絨毛培養(yǎng)細胞染色體核型結果顯示為男胎8例，女胎2例，13、18和21號染色體的數目均正常。（2）實驗組和對照組的結果符合率為90％。FISH組每

10、例標本耗時24h，雖然標本也需4天的細胞培養(yǎng)，所需細胞量還是相對較少的。通過差速貼壁法可以盡可能的去除一些母體細胞，能夠在相對較短的時間內富集滋養(yǎng)細胞的數目，達到產前診斷的目的。絨毛組織一般需經歷5-7天的培養(yǎng)才可以收獲細胞。
　　 (3)應用國產探針進行標本檢測的過程中，適當的改變探針的變性溫度及胃蛋白酶的消化時間，并將之前用甲酰胺變性標本和洗滌標本的過程省去，因為甲酰胺易揮發(fā)并具有一定的致癌作用，在適度的修改步驟后，也能得出