骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠肺移植急性排斥反應(yīng)的保護(hù)作用.pdf

1、本文研究了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠肺移植急性排斥反應(yīng)的保護(hù)作用。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：
　　 目的：探討如何建立穩(wěn)定的小鼠原位左肺移植模型。
　　 方法：雄性FVB 小鼠隨機(jī)分成供體和受體，采用自創(chuàng)的三套管法建立小鼠原位左肺移植模型。
　　 結(jié)果：手術(shù)成功率在90％以上，冷缺血時(shí)間35.6±5.9min，熱缺血時(shí)間25.3±7.2min，供肺準(zhǔn)備時(shí)間21±5.6min，整個(gè)手術(shù)時(shí)間85±15

2、min，術(shù)后受體存活時(shí)間達(dá)到30d以上，術(shù)后一月顯微CT 顯示左肺野清晰，左支氣管通暢，阻斷小鼠右側(cè)肺門前后，檢測(cè)動(dòng)脈血?dú)?，結(jié)果無(wú)顯著性差異。術(shù)后一月病理學(xué)檢查顯示肺移植物結(jié)構(gòu)基本正常，與正常右側(cè)肺相似，肺泡通氣功能良好。
　　 結(jié)論：在大鼠原位左肺移植模型的基礎(chǔ)上，自行摸索，獨(dú)立地建立了成功的小鼠肺移植模型，與國(guó)外建立的該模型相比，我們的方法具有操作簡(jiǎn)便易行，模型穩(wěn)定的特點(diǎn)，這在國(guó)內(nèi)屬于首創(chuàng)，為肺移植的基礎(chǔ)研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)

3、。
　　 第二部分：
　　 目的：探討應(yīng)用生物發(fā)光技術(shù)在體監(jiān)測(cè)小鼠肺移植排斥反應(yīng)以及評(píng)價(jià)抗排斥反應(yīng)藥物環(huán)孢霉素治療效果的可能性。在體監(jiān)測(cè)器官移植排斥反應(yīng)具有很大的臨床應(yīng)用前景。當(dāng)前，診斷排斥反應(yīng)的金指標(biāo)是活組織檢驗(yàn)，該方法不僅具有侵襲性，而且還可能造成樣本誤差。本研究的目的是為了探索采用生物發(fā)光顯像技術(shù)活體監(jiān)測(cè)肺移植排斥反應(yīng)的可能性，并進(jìn)一步使用該方法評(píng)價(jià)不同劑量抗排斥反應(yīng)藥物環(huán)孢霉素的治療效果。
　　 方法：采

4、用表達(dá)生物熒光素酶-綠色熒光蛋白(Luc-eGFP)的轉(zhuǎn)基因L2G85小鼠(H-2q)作為供體，Balb/c(H-2d)或 FVB(H-2q)小鼠作為受體，建立小鼠左肺原位肺移植模型。定期檢測(cè)供體肺散發(fā)的生物熒光信號(hào)強(qiáng)度。不同的時(shí)間點(diǎn)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取出供肺組織行HE 染色，觀察肺組織病理學(xué)改變。
　　 結(jié)果：所有肺移植物均在移植后7天左右排斥，生物熒光信號(hào)強(qiáng)度(BLI)在7天左右下降到基礎(chǔ)值的5％以下(1.35±0.1％)，到移

5、植后2周，移植物生物熒光信號(hào)降到背景水平。相反在同基因移植FVB 受體小鼠內(nèi)，生物熒光信號(hào)強(qiáng)度在2周仍然超過(guò)基礎(chǔ)強(qiáng)度的80％(89.6±4.5％)。我們同時(shí)使用不同劑量環(huán)孢霉素，抑制同種異體小鼠肺移植物的排斥反應(yīng)，10mg/kg/d、20mg/kg/d和30mg/kg/d，生物熒光信號(hào)結(jié)果顯示，移植術(shù)后28天，20mg/kg/d組生物熒光信號(hào)強(qiáng)度與基礎(chǔ)值相比，遠(yuǎn)大于10mg/kg/d組(41.05±4％ VS14.87±3％，P<0.0

6、5)，但是和30mg/kg/d組沒(méi)有很明顯的區(qū)別(41.05±4％ VS44.49±4％,P>0.05)。
　　 結(jié)論：生物熒光顯像技術(shù)能可靠地活體連續(xù)監(jiān)測(cè)小鼠肺移植排斥反應(yīng)，并能監(jiān)測(cè)環(huán)孢霉素的免疫抑制效果，將來(lái)臨床上可以應(yīng)用該策略，有利于建立個(gè)體化的抗排斥反應(yīng)治療方案。
　　 第三部分：
　　 目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用。靜脈注射后，該細(xì)胞大量滯留在肺內(nèi)，滯留在肺內(nèi)的細(xì)胞是否能夠抑制

7、肺移植排斥反應(yīng)呢？本實(shí)驗(yàn)將對(duì)此展開研究并探討其可能的機(jī)制。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分兩部分，第一部分，檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后植入到肺內(nèi)的情況。1X106L2G85來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈分別注射至正常組、假手術(shù)組以及肺移植組小鼠體內(nèi)，通過(guò)監(jiān)測(cè)生物熒光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)追蹤細(xì)胞的存活情況(n=5/組)。第二部分，研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)同種異基因肺移植物排斥反應(yīng)的保護(hù)作用。使用L2G85小鼠為供體，Balb/c 小鼠為受體，建立小鼠

8、左肺原位移植模型，隨機(jī)分成3組，對(duì)照組、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組和環(huán)孢霉素治療組(n=20/組)，對(duì)照組接受PBS100ul 尾靜脈注射，共5天；細(xì)胞治療組接受FVB小鼠來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞尾靜脈注射，1X106/d，共5天；環(huán)孢霉素組接受環(huán)孢霉素20mg/kg/d 腹腔注射直到實(shí)驗(yàn)終末時(shí)間點(diǎn)。移植術(shù)后第7天，處死部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，切取肺移植物，流式細(xì)胞檢測(cè)移植術(shù)后移植肺內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中CD4+FOXP3+Treg以及CD8+IFN-γ+

9、Tc的比例；肺組織行HE 染色觀察組織的病理變化；切取受體脾臟，分離脾細(xì)胞行酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)移植受體的免疫反應(yīng)類型。部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物定期檢測(cè)供體肺散發(fā)的生物熒光信號(hào)強(qiáng)度直至移植后第21天。
　　 結(jié)果：第一部分實(shí)驗(yàn)，在正常組、假手術(shù)組和肺移植組中，小鼠尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，生物熒光顯像提示早期細(xì)胞主要滯留于肺內(nèi)，左右肺內(nèi)細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度基本相同，24h后左右肺內(nèi)細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度在三組中均急劇降低，肺移植組左肺下降幅度最小，肺移植

10、組右肺以及假手術(shù)組下降幅度其次，正常組下降幅度最大，第三天，除肺移植組左肺可以檢測(cè)到較強(qiáng)熒光信號(hào)外，其他組以及肺移植組右肺，熒光信號(hào)強(qiáng)度均降到背景水平；第二部分實(shí)驗(yàn)，在移植術(shù)后第7天，與基礎(chǔ)值對(duì)比，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組生物熒光信號(hào)強(qiáng)度與環(huán)孢霉素組相近，差異沒(méi)有顯著性(66.7±8％vs63.9±4.5％)P>0.05，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組較PBS組生物熒光信號(hào)強(qiáng)，差異有顯著性(66.7±8％vs1.62±0.4％)P<0.05，在術(shù)后1

11、4天，PBS組信號(hào)降到背景水平，細(xì)胞移植組和環(huán)孢霉素組熒光信號(hào)強(qiáng)度相似，分別為基礎(chǔ)值的(42.3±3.5vs46.6±5.4％)，細(xì)胞移植組和環(huán)孢霉素組相比，差異沒(méi)有顯著性，P>0.05，細(xì)胞治療組、環(huán)孢霉素組與PBS組相比，差異有顯著性，P<0.05。但是到術(shù)后21天，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組熒光信號(hào)顯著降低，略強(qiáng)于背景水平，為基礎(chǔ)值的0.21±0.5％，環(huán)孢霉素組熒光信號(hào)為基礎(chǔ)強(qiáng)度的41.64±3.5％，差異有顯著性，P<0.05。移

12、植術(shù)后第7天肺移植物病理切片結(jié)果顯示：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組和環(huán)孢霉素治療組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，肺泡通氣功能良好，但是PBS組顯示肺泡塌陷，肺泡間隔增厚，肺間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。在術(shù)后第7天，供肺移植物浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中，MSC細(xì)胞治療組CD4+FOXP3+Treg 所占比例顯著高于PBS組(32.04±2.5％ VS15.5±1.7％)P<0.05。CD8+IFN-γ+細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞所占比例明顯低于PBS組(27.6±1.4％ VS 5

13、5.2±6.7％)P<0.05。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IFN-γ 斑點(diǎn)在三組中分別為：PBS組404±35/106細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組為200±23/106細(xì)胞，環(huán)孢霉素組為196±26/106細(xì)胞，IL-4 斑點(diǎn)在三組中分別為：PBS組為38.7±5.4/106細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組為75±10/106細(xì)胞，環(huán)孢霉素組為18±2.9/106細(xì)胞。
　　 結(jié)論：在此實(shí)驗(yàn)中，我們證實(shí)了，靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，細(xì)胞早