妊高征患者胎盤組織差異表達基因的篩選與確定.pdf

1、妊娠高血壓綜合癥(pregnancy-induced hypertension,PIH)是圍產(chǎn)期母嬰死亡的主要原因之一.在人類基因組計劃完成后,疾病基因組計劃及其相關的表達遺傳學研究已經(jīng)啟動,并成為當今分子醫(yī)學研究的主要內容之一.妊高征胎盤與正常胎盤相比,在基因表達方面有哪些差異?基因表達的差異與妊高征的臨床表現(xiàn)有何聯(lián)系?差異基因表達的產(chǎn)物能否在蛋白水平上分子水平保持一致?為了了解這些差別,同時為了證實這些差別在大范圍妊高征病人中具有普

2、遍的意義,我們進行了以下研究:1妊高征病人數(shù)據(jù)庫的建立(construction of PIH database); 2組織芯片的制備,在每張組織切片上選2-3個不同的的視野,以組織直徑為3mm,間距1mm制作胎盤組織芯片.3抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)在妊高征病人數(shù)據(jù)庫中選取年齡、孕周、手術終止妊娠時間相近的2例重度妊高征病人胎盤組織提取總RNA.考慮到胎兒表型對結

3、果的影響,2例病人分娩的胎兒性別不同.變性凝膠電泳顯示RNA質量滿意后將2例病人胎盤組織總RNA等量混合,作為tester. 4基因克隆; 用Premega公司的T-Aeasy Kit克隆妊高征胎盤組織cDNA文庫基因. 5反向點雜交;將轉化菌鋪板,隨機挑選384個白色菌落,搖菌;以菌液為模板,PCR擴增目的片段,用PCR產(chǎn)物點膜,分別用正向、反向消減的擴增后cDNA文庫制備P<'32>標記探針.反向探針與正向探針在同一條件下與所選菌落

4、雜交.比較雜交信號值,選信號值差別大于3的菌落測序.6DNA序列測定;將所選的cDNA片段用T7法測序.將所測序列進行BLASTN同源分析,以同源性大于95﹪為標準,初步確定候選差異表達基因.8選取4例妊高征病人胎盤和4例正常孕婦胎盤.將4例正常胎盤組織總RNA等量混合作為整體對照,利用上海聯(lián)合基因公司生產(chǎn)的4000點cDNA表達譜芯片檢查妊高征胎盤差異表達基因.9反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR);根據(jù)初步篩選出來的差異表達基因,用R