膽固醇對大鼠皮質神經元Aβ產生的影響及雌激素的可能作用.pdf

1、老年性癡呆又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是一種好發(fā)于中老年人的神經退行性變疾病，以記憶丟失和認知功能障礙為典型臨床表現。其病因目前尚不清楚，大多認為是一種多病因疾病。近幾年許多研究者從各個不同的角度如淀粉樣蛋白沉積、雌激素改變、炎癥介質、免疫因素、膽固醇因素等探討AD的病因病理機制和治療手段，提出了多種假說。其中膽固醇過載假說和雌激素缺乏假說的尤為引人注目。前者認為，膽固醇與淀粉樣前體蛋白(amylo

2、id precursor protein，APP)的降解密切相關，在Aβ的產生和異常沉積過程中具有重要調節(jié)作用，膽固醇過載會導致Aβ的產生增多和過度聚集，引發(fā)老年斑的產生。后者指出，雌激素缺乏可能與AD的發(fā)病有關。流行病學證實，女性絕經后AD患者多于男性，約為1.5～3：1，而雌激素替代療法(estrogen replacement therapy,ERT)可以降低AD的發(fā)病率。雌激素可以通過多種機制對中樞神經系統(tǒng)發(fā)揮保護作用，同時，雌

3、激素還可以影響脂質代謝的酶類，發(fā)揮降膽固醇的作用，ERT治療高脂血癥的效果甚至優(yōu)于單用降脂藥物。臨床實驗證實，他汀類降脂藥物對AD具有治療作用。由此可以推斷，雌激素和他汀類對AD的治療作用與膽固醇的代謝可能有一定程度的關聯。 目的：本課題以體外培養(yǎng)的SD胎鼠皮質神經元為研究對象，觀察膽固醇對神經元Aβ產生的影響，探討膽固醇在AD病理發(fā)病機制中的作用。同時以具有明確降膽固醇作用的洛伐他汀組為對照，揭示雌激素對抗膽固醇損傷作用的可能

4、機制，探討其是否具有體外降膽固醇作用，為進一步的體內實驗奠定理論基礎。方法：SD胎鼠大腦皮質神經元原代培養(yǎng)，接種于96孔和6孔培養(yǎng)板內。隨機法分為5組： (1)膽固醇組：神經元體外生長7d后，培養(yǎng)液內加入膽固醇(8μg/ml)，持續(xù)作用2d、5d； (2)雌激素+膽固醇組：神經元體外生長5d后加入17β-雌二醇(10ng/ml，無水乙醇溶解)，作用2d后換含有膽固醇(8μg/ml)的培養(yǎng)液，持續(xù)作用2d、5d；

5、(3)雌激素組：神經元體外生長5d后，培養(yǎng)液內加入17β-雌二醇(10ng/ml，無水乙醇溶解)，持續(xù)作用4d、7d； (4)洛伐他汀組：神經元體外生長5d后，培養(yǎng)液內加入洛伐他汀(4μmol/L，無水乙醇溶解)，持續(xù)作用4d、7d； (5)正常對照組：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)持續(xù)培養(yǎng)9d、12d。 各組細胞培養(yǎng)9d、12d后終止培養(yǎng)，分別用MTT檢測各細胞存活數量和活力、流式細胞術檢測細胞的線粒體膜電位(△ψm)變化、

6、雙抗體夾心法Elisa檢測細胞培養(yǎng)液內的Aβ40的含量、RT-PCR法檢測細胞內APP、BACE1 mRNA的相對表達量。所得數據結果用均數±標準差(-X±S)表示，利用SPSS15.0統(tǒng)計學軟件分析，P<0.05有統(tǒng)計學意義。計量資料多組均數比較采用方差分析。 結果： 1.本實驗建立了SD胎鼠皮質神經元原代培養(yǎng)方法，細胞生長狀態(tài)好，培養(yǎng)至7d時鑒定顯示，神經元比例為90％±4.6％，神經元細胞純度高，符合實驗要求。

7、 2.不同干預條件下，生長9d的各組細胞MTT檢測，各組A值分別為：膽固醇組0.719±0.033；雌激素+膽固醇組0.737±0.055；洛伐他汀組0.742±0.067；雌激素組0.733±0.045；正常組0.728±0.041。各組間細胞存活數量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。繼續(xù)作用3d后，也即生長12d時各組細胞的A值分別為：膽固醇組0.602±0.031；雌激素+膽固醇組0.727±0.040；洛伐他汀組0.725±

8、0.039；雌激素組0.721±0.085；正常組0.703±0.059。其中，膽固醇組的細胞活力明顯低于正常組，t=6.413，P<0.01，差異有統(tǒng)計學意義，而雌激素+膽固醇組與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 3.不同干預條件下各組細胞的△ψm，以膽固醇組下降最多。各組正常細胞，即發(fā)紅色高強度光細胞的百分率分別為：膽固醇組：74.4％±3.37％；雌激素+膽固醇組：89.5％±4.52％；正常組：91.3

9、％±5.17％。膽固醇組與正常組之間均數t檢驗顯示，P<0.01，差異有統(tǒng)計學意義。雌激素+膽固醇組與正常組比較，P>0.10，差異無統(tǒng)計學意義。 4.雙抗體夾心法Elisa檢測得知，培養(yǎng)液內Aβ40在各組的含量分別是：膽固醇組：491.2±31.14pg/ml；雌激素組：295.8±23.13pg/ml；洛伐他汀組：244.9±22.73pg/ml；正常組：280.9±25.58pg/ml。膽固醇組培養(yǎng)液內Aβ40含量顯著高于

10、正常對照組，兩組均數t檢驗顯示：t=16.502，P<0.001，差異有統(tǒng)計學意義。洛伐他汀組含量低于正常組，P=0.04，差異有統(tǒng)計學意義。雌激素組與正常組比較t=-1.366，P=-0.189，差異無統(tǒng)計學意義。不同的膽固醇作用濃度下，對應培養(yǎng)液內Aβ40的含量為：膽固醇4μg/ml，Aβ40 321±27.18pg/ml；膽固醇8μg/ml，Aβ40491.2±31.14pg/ml；膽固醇16μg/ml，Aβ40 553±34.1

11、8pg/ml；膽固醇32μg/ml，Aβ40 562±37.46pg/ml；膽固醇64μg/ml，Aβ40 564±40.23pg/ml。膽固醇濃度較低時，Aβ40隨著膽固醇濃度的增高而增高，繼而保持在一個較高的水平。 5.各組細胞BACE1 mRNA的灰度與內參GADPH的灰度比較，比值分別為：膽固醇組：0.779±0.065；洛伐他汀組：0.738±0.029；雌激素組：0.781±0.061；正常組：0.748±0.057

12、。多組均數方差分析顯示，P>0.05，各組之間差異無統(tǒng)計學意義，膽固醇、雌激素不能影響神經元BACE-1的mRNA表達。 6.各組細胞APPmRNA的灰度與內參GADPH的灰度比較，比值分別為：膽固醇組：1.31±0.058；洛伐他汀組：0.69±0.037；雌激素組：0.88±0.042；正常組：0.82±0.051。膽固醇組與正常對照組相比顯著增高，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，洛伐他汀組與正常組相比，有明顯降低，其差

13、異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而雌激素組與正常組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結論： 1.實驗濃度的膽固醇(8μg/ml)對體外培養(yǎng)的神經元具有損傷作用，可以使原代培養(yǎng)的神經元細胞線粒體膜電位下降，從而加速凋亡，使活細胞數量和活力明顯下降。膽固醇引起Aβ增多可能是膽固醇損傷作用的重要原因之一。而雌激素預先作用2d可以對抗膽固醇引起的神經元損傷。 2.體外8μg/ml的膽固醇濃度可以使原代培養(yǎng)神經元的

14、APP mRNA的表達水平顯著增高，洛伐他汀可以有效抑制這一增高趨勢，而雌激素不能抑制這一增高趨勢。雌激素和膽固醇均不能調節(jié)BACE-1 mRNA的表達水平。 3.實驗濃度的膽固醇可使原代培養(yǎng)神經元產生的Aβ40顯著增多，且增多程度與膽固醇濃度呈正相關。洛伐他汀可以通過降低膽固醇的含量而使Aβ40明顯減少，而雌激素不能抑制體外Aβ40的產生。 4.膽固醇引起Aβ40增多可能是通過上調APP的表達，同時增加BACE-1的活