多壁碳納米管的心血管毒性研究.pdf

1、背景：
　　 心血管疾病是全球范圍內(nèi)造成死亡的最主要原因。大量流行病學(xué)研究表明,心血管疾病與空氣顆粒(particulate matter,PM)污染物暴露有關(guān)。各種PM對(duì)心血管系統(tǒng)損傷很大,而且顆粒物體積越小,危害性越大。
　　 多壁碳納米管(MWCNTs)是屬于納米級(jí)顆粒,主要應(yīng)用于納米線圈、電子元件、催化劑等,并逐漸發(fā)展到藥物載體等生物醫(yī)藥領(lǐng)域,其心血管暴露的機(jī)會(huì)增加,但目前對(duì)其生物安全性評(píng)價(jià)主要集中于肺毒性的研究

2、。研究表明MWCNTs誘發(fā)肺部和／或全身的炎癥反應(yīng),并使血管血紅素氧合酶(heme oxygenase-1,HO-1)基因活化及氧化損傷,可能引起血管內(nèi)皮功能損傷,形成前凝聚狀態(tài),具有一定的心血管系統(tǒng)毒性效應(yīng)。內(nèi)皮損傷是血管病理改變的主要早期事件,最終可引起一系列心血管相關(guān)的疾病。我們前期的研究表明,MWCNTs可引起內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生DNA損傷和凋亡。本課題用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法,研究MWCNTs對(duì)內(nèi)皮損傷的機(jī)制,為后期的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。<

3、br>　　 在明確MWCNTs對(duì)內(nèi)皮的損傷作用之后,采用SD大鼠高脂飲食誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化模型,觀察MWCNTs的心血管系統(tǒng)毒性。考慮到肺部炎癥和脂肪肝程度都與心血管系統(tǒng)密切相關(guān),所以,除了觀察心臟、主動(dòng)脈和血液,還有肺臟和肝臟。
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證MWCNTs對(duì)AS的影響,并且比較其他碳納米材料的影響程度,本項(xiàng)目采用典型的高脂飲食LDLR-／-小鼠高脂飲食誘發(fā)高脂血癥模型,比較研究了單壁碳納米管(SWCNTs)、MWCNTs

4、和多壁碳納米圈(MWCNOs)的心血管毒性。
　　 目的、方法和結(jié)果：
　　 1為了研究MWCNTs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變情況,進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)。其中體內(nèi)實(shí)驗(yàn)把1％Tween80作為溶劑對(duì)照組,200μg／kg單壁碳納米管和1 mg／kg脂多糖作為陽(yáng)性對(duì)照組,觀察200μg／kg MWCNTs連續(xù)靜脈注射7 d后,利用免疫組化和western blot測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞vWF的表達(dá)情況；用ELISA測(cè)定血漿中的vW

5、F和sICAM-1,綜合評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷情況。體外實(shí)驗(yàn)把完全培養(yǎng)液作為溶劑對(duì)照組,觀察各濃度的MWCNTs對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)作用不同時(shí)間后,利用電阻儀測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞的電阻,western blot測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1的表達(dá)情況,評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞的功能性損傷；利用臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力；western blot測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞procaspase-3、活化的caspase-3、p62和Atg8蛋白,評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制。結(jié)果表明

6、:200μg／kg MWCNTs連續(xù)靜脈注射SD大鼠7d后,內(nèi)皮細(xì)胞vWF表達(dá)增加,并分泌進(jìn)入血液,造成內(nèi)皮功能性和結(jié)構(gòu)性損傷,導(dǎo)致血液中sICAM-1水平降低(P<0.05)；不同濃度的MWCNTs作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)0-48 h,TEER降低,并有時(shí)間和濃度依賴效應(yīng)；不同濃度的MWCNTs處理24 h后,ZO-1蛋白表達(dá)降低,內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加(P<0.05),細(xì)胞活力降低,procaspase-3、活化的cas

7、pase-3、p62三個(gè)蛋白表達(dá)降低,而LC3-Ⅰ／LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化升高(P<0.05)。
　　 2為了研究50、100和200μg／kg多壁碳納米管(MWCNTs)連續(xù)處理高脂飲食SD大鼠1-4個(gè)月后對(duì)血液、心、主動(dòng)脈、肝和肺的影響,HE染色觀察心、主動(dòng)脈、肝和肺部的病理情況；油紅O染色和茜素紅染色分別觀察主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積和主動(dòng)脈鈣化；用各個(gè)試劑盒測(cè)定血清和肝中的CHOL、TG和HDL-c,反映血脂和肝中脂類的情況,測(cè)定血清

8、和肝中的GSH、MDA和T-SOD,反映氧化情況,測(cè)定血清和肝中的GOT、GPT和γ-GT,反映肝功；熒光定量PCR測(cè)定肺部炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平。結(jié)果表明:MWCNTs升高血清中的TG水平；50、100和200μg／kg MWCNTs作用2-4個(gè)月,主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積面積增加,肺間隔不同程度增厚,形成大小不同的肺肉芽腫塊,GOT、GPT、γ-GT、GSH、T-SOD和MDA受到不同程度影響,肝中的脂類發(fā)生變化；5

9、0、100、200μg／kg MWCNTs作用2或4個(gè)月,主動(dòng)脈鈣化程度加重。
　　 3進(jìn)一步驗(yàn)證MWCNTs對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響,并與SWCNTs和MWCNOs進(jìn)行比較。分別用SWCNTs(2 mg／kg)、MWCNTs(2 mg／kg)和MWCNOs(20 mg／kg)分別處理高脂飲食LDLR-／-小鼠3個(gè)月后,用HE染色觀察心、主動(dòng)脈、肺、肝和脾的病理情況；用各個(gè)試劑盒測(cè)定血清中的CHOL、TG、LDL-c和HDL-c,反

10、映血脂的情況；用各個(gè)試劑盒測(cè)定血清中的GSH、MDA和T-SOD,反映氧化情況；用各個(gè)試劑盒測(cè)定血清中的GOT、GPT和γ-GT,反映肝功。結(jié)果表明:SWCNTs、MWCNTs和MWCNOs都使肺間隔增厚,肺部肉芽腫形成,但MWCNTs在肺部蓄積更多,使肺臟系數(shù)增大(P<0.01),形成更多更大的肉芽腫； MWCNTs和MWCNOs使心臟系數(shù)和脾臟系數(shù)明顯降低；SWCNTs、MWCNTs和MWCNOs都使血脂降低,主動(dòng)脈脂肪變程度降低；