p38絲裂原活化蛋白激酶在豬MODS中對內(nèi)皮祖細胞的調(diào)控機制的研究.pdf

1、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome MODS)是臨床危重患者死亡的主要原因之一。目前其發(fā)病機制尚不明確,臨床治療上缺乏有效的手段。1997年,Asahara等首先從外周血單個核細胞(PBMCs)里分離出一種被稱為內(nèi)皮祖細胞(EPC)的祖細胞亞群,這些細胞具有在體內(nèi)外增殖、遷徙和分化為成熟內(nèi)皮細胞的能力以來,干/祖細胞技術(shù)和理論得到了迅猛發(fā)展,多器官功能障礙綜合征的發(fā)病機制研究和臨

2、床治療也面臨著新的契機。有研究表明,機體損傷后,血循環(huán)中具有多向分化潛能的祖細胞一方面可以在VEGF等生長因子作用下動員、增殖、遷徙入損傷器官,分化為相應(yīng)的內(nèi)皮細胞進行損傷修復(fù)；另一方面內(nèi)皮細胞不僅是炎癥反應(yīng)的參與者,還是首先受損的靶細胞,并進而造成微血管損傷、微循環(huán)障礙,這可能是器官功能障礙的始發(fā)環(huán)節(jié)。大量的動物和臨床實驗都已經(jīng)證明：當(dāng)組織受到損傷時,尤其是缺血性損傷時,循環(huán)及組織中EPC動員和增殖能力增強,并可以在組織內(nèi)分化為內(nèi)皮細

3、胞替換功能障礙的內(nèi)皮細胞、修補裸露的血管內(nèi)皮損傷區(qū),并參與缺血或損傷組織內(nèi)新血管生成,從而改善缺血器官的功能；而如果創(chuàng)傷后EPC的分化、遷徙功能發(fā)生嚴重障礙,則會導(dǎo)致?lián)p傷微循環(huán)嚴重損害而無法得到修復(fù),甚至發(fā)生器官功能衰竭。 近年來,人們已逐漸認識到MODS是機體對于多種嚴重損傷的一種過度的、全身性炎癥反應(yīng)的最終結(jié)果,以大量促炎因子(例如:TNF-a、IL-1β等)的過度釋放或者抗炎因子(如IL-4、IL-10等)出現(xiàn)釋放延遲為標

4、志的過度炎癥反應(yīng)綜合征或抗炎反應(yīng)綜合征,最終導(dǎo)致機體免疫失衡和MODS的發(fā)生,和各種免疫細胞一樣,EPC也受到了細胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。在MODS中,內(nèi)毒素與缺血等可以使外周血單核細胞內(nèi)的p38絲裂原活化蛋白激酶磷酸化,活化轉(zhuǎn)錄因子AP-1,進而引起TNF-a、IL-1β基因轉(zhuǎn)錄增強,TNF-a、IL-1β產(chǎn)生增多,進而導(dǎo)致EPC下降,MODS加重。 本實驗擬在建立豬MODS動物模型和EPC體外培養(yǎng)和鑒定實驗體系基礎(chǔ)上,研究觀察豬各

5、主要臟器功能變化與外周血單核細胞p38MAPK磷酸化變化與TNF-a、IL-18mRNA的表達變化和外周血血漿TNF-a、IL-1β濃度及EPC數(shù)量與功能的變化,以及在體外用不同濃度的TNF-a與IL-1β培養(yǎng)EPC,觀察其數(shù)量與功能的變化與EPC內(nèi)的p38MAPK的變化；并探討在MODS中p38MAPK介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路對EPC的調(diào)控作用,從內(nèi)皮祖細胞分化障礙的角度進一步研究創(chuàng)傷后MODS的發(fā)病機制。 全文共分三部分：

6、 第一部分 EPC的體外培養(yǎng)與生物學(xué)特性研究。方法：抽取豬骨髓20ml,用密度梯度離心法得到單核細胞,將單核細胞懸液按2×106/ml密度接種于直徑10厘米的含有各種細胞因子的培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中培養(yǎng),培養(yǎng)2天可出現(xiàn)梭形細胞,6天后梭形樣細胞數(shù)明顯增多,部分成鵝卵石狀貼壁生長,進而形成細胞網(wǎng)或者管腔樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)后的細胞傳至第3代后,在免疫組化鑒定:CD133(+),CD34(+),CD31(++),KDR(++),FITC-UEA-I和Di

7、l-acLDL雙吞噬實驗為陽性,血管生成實驗為陽性,FCM檢測貼壁細胞CDl33的陽性率：18.23±7.12％；CD34的陽性率：47.71±14.85％；CD31的陽性率：71.61±13.51％；KDR的陽性率：87.24±11.40％,鑒定為EPC。在體外將TNF-a、IL-1β的標準品分別加入第3代EPC,觀察其對EPC的數(shù)量、增殖、遷移、貼壁、血管新生功能的影響。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)其數(shù)量與功能與TNF-a、IL-1β有濃度與時間依賴

8、性下降,并且有顯著的差異(P<0.01),并且與p38MAPK的磷酸化密切相關(guān),用p38MAPK的特異性抑制劑SB203580(1umol/L)能減輕EPC的數(shù)量與功能下降。結(jié)論：體外TNF-a、IL-1β通過p38MAPK的磷酸化使EPC數(shù)量與功能下降,SB203580能防止EPC數(shù)量與功能下降。 第二部分 利用改良Wiggers方法復(fù)制失血性休克模型,首次打擊(失血性休克、復(fù)蘇再灌注)和二次打擊(內(nèi)毒素)復(fù)合因素成功建立豬M

9、ODS模型。方法：20頭豬隨機分為：正常對照組(C組,n=10),失血性休克+復(fù)蘇再灌注+內(nèi)毒素組(M組,n=10);通過給豬放血致平均動脈壓50±5mmHg,維持1.5-2h,然后回輸60％所失血液和兩倍平衡液復(fù)蘇,12h后由靜脈持續(xù)滴入內(nèi)毒素(sigma,劑量0.5mg/Kg),24小時滴完。連續(xù)動態(tài)監(jiān)測心、肺、腎、肝、胃腸等功能,七天后處死存活動物。用自動分析儀檢測各時間點ALT、AST、Cr、 BUN、 CO、PaO2等指標,觀

10、察主要器官病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:M組外周血ALT、AST、Cr、BUN均明顯升高,動物死亡前顯著高于正常值(P<0.01),CO,PaO2明顯下降(P<0.01);病理學(xué)改變主要以非特異炎癥改變?yōu)橹?。M組各器官的衰竭率：肺80.0％(8例),胃腸道70.0％(7例),肝50.0％(5例),腎30.0％(3例),心功能障礙(2例)20.0％, MODS發(fā)生率達90.0％(9例),死亡率達80.0％(8例),顯著高于對照組。結(jié)論：利用二次打

11、擊方法,可以成功復(fù)制出動物MODS模型,且模型MODS發(fā)生率高,死亡率高,臨床典型的雙相遲發(fā)MODS相似重復(fù)性好。 第三部分 MODS體內(nèi)單核細胞內(nèi)p38MAPK的磷酸化對TNF-a、IL-1β合成、分泌及外周血EPC的數(shù)量與功能的影響。方法：在體內(nèi)Western-blot法檢測外周血單核細胞p38MAPK磷酸化變化與Realtime-PCR法測定TNF-amRNA、IL-1βmRNA的表達變化和ELISA法測定外周血血漿TN

12、F-a與IL-1β濃度變化及FCM檢測外周血EPC數(shù)量的變化。結(jié)果:MODS中外周血單核細胞p38MAPK的磷酸化明顯增強(P<0.01),TNF-a與IL-1β合成與分泌明顯增加(P<0.01)。外周血EPC數(shù)量與功能下降(P<0.05);體外TNF-a與IL-1β通過EPC內(nèi)的p38MAPK的磷酸化使EPC的數(shù)量與功能下降。結(jié)論：在MODS的發(fā)病機制中,外周血單核細胞p38MAPK的磷酸化使TNF-a與IL-1β等炎性因子的轉(zhuǎn)錄、合