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文檔簡介
1、研究背景:
我國冠心病發(fā)病率正逐年攀升并呈年輕化趨勢,而急性心肌梗死(Acutemyocardial infarction,AMI)是冠心病最為兇險的一種類型,我國每年約百余萬患者死于AMI。因此,該病被視為“人類健康第一殺手”。
隨著冠脈搭橋術、經皮冠脈腔內成形術等血管再通術同臻成熟,AMI的再灌注治療被廣泛開展。及時恢復冠脈血流是挽救急性缺血心肌的根本措施,但心肌在恢復血流的同時也會導致再灌注損傷,即所謂
2、的心肌缺血-再灌注(Ischemia-Reperfusion,I-R)損傷,如何有效減輕這種損傷,使再灌注治療最大獲益成為AMI治療的最大挑戰(zhàn)。
黃芩苷(baicalin)是從廣泛使用的中藥黃芩(Scutellaria baicalensis Georigi)的干燥根中提取的一種黃酮類化合物,黃芩苷是黃芩的主要生物活性成分之一,具有多重藥理作用,如抗菌、鎮(zhèn)靜、減輕炎癥反應及較強的抗氧化等特性。因而,近年來被廣泛研究。黃芩苷
3、多種病理生理條件下被廣泛研究,最近有研究報道黃芩苷預處理能有效減輕肝臟及腦組織的I-R損傷。在一些體外研究中,黃芩苷及其苷元黃芩素被報道具有保護心肌損傷的作用。最近,一項體外研究報道:黃芩苷預處理可通過抗炎機制緩解培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞凋亡。Tu IH等也報道黃芩苷能減少缺氧-復氧誘導的心肌細胞凋亡。然而,黃芩苷在缺血性心臟疾病中的在體研究較少。Peng及其同事近期研究證實:口服黃芩苷預處理能通過抗氧化機制有效保護心肌缺血性損傷。然而,
4、黃芩苷對心肌缺血再灌注損傷的體內研究及相關機制未見報道。
研究證實氧自由基過度形成及鈣超載是導致心肌I-R損傷的主要因素。持續(xù)的心肌缺血及缺血后心肌再灌注均可導致心肌細胞凋亡,盡管再灌注可減少凋亡心肌細胞數,但卻使不可逆轉的心肌細胞加速凋亡。這是由于再灌注早期ROS爆發(fā),在這種氧化應激條件下,線粒體通透性轉換孔大量開放,線粒體功能障礙可導致細胞凋亡。我們提出假說:黃芩苷預處理通過抑制線粒體損傷介導的凋亡保護心肌缺血再灌注損
5、傷。
目的:
1.建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型,在動物體內水平證實黃芩苷預處理對心肌缺血再灌注損傷的作用;
2.探索黃芩苷能否通過減輕線粒體損傷介導的凋亡保護心肌缺血再灌注損傷。
對象和方法:
第一部體內實驗
本實驗選用野生型小鼠(8至10周齡,體重25至28g的雄性C57 BL/6小鼠),結扎冠狀動脈左前降支45分鐘后解除結扎線2小時,構建小鼠心肌缺
6、血再灌注損傷模型。預實驗中,實驗對象被分成5組:假手術組、Vehicle(生理鹽水)+缺血再灌注(I/R)組;黃芩苷(50 mg/kg)+I/R組;黃芩苷(100 mg/kg)+I/R組;黃芩苷(200 mg/kg)+I/R組,實驗設計、分組情況及相應結果見“本研究預實驗數據與結果”部分。確定最佳藥物劑量(100 mg/kg)后,小鼠被隨機分成3組:假手術組、Vehicle(生理鹽水)+缺血再灌注(I/R)組;黃芩苷(100 mg/kg
7、)+I/R組。黃芩苷或生理鹽水于冠狀動脈左前降支結扎前10分鐘經靜脈輸注。(備注:心肌梗死指標中每組n=8;左室功能測定每組n=7;檢測凋亡及免疫組化分析時每組n=6;線粒體損傷分析每組n=4;抗氧化檢測每組n=5;蛋白免疫分析每組n=3)。
第二部體外實驗
建立心肌細胞缺氧/復氧模型,模擬心肌缺血再灌注過程。乳鼠原代心肌細胞分離和培養(yǎng):采用胰酶/膠原酶消化法。分為對照組(常氧組),vehicle+缺氧/復氧
8、組和Baicalin+缺氧/復氧組,每組設3個復孔,實驗重復3次。觀察心肌細胞搏動和形態(tài)學變化,CCK8法檢測心肌細胞活力;TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡水平;試劑盒檢測LDH及SOD表達水平。
所有統(tǒng)計學處理均采用SPSS13.0專業(yè)軟件進行統(tǒng)計學分析,所有數值均被表達為均數±標準差(x±s)。對各組數據進行方差齊性檢驗,若方差齊,則組間比較用方差分析,兩兩比較用最小顯著差異法(least significant dif
9、ference,LSD)方法;當方差不齊時,組間比較采用Welch法進行近似方差分析,兩兩比較用Dunnett's T3。P<0.05被認為數據差異具有統(tǒng)計學意義。
結果:
1.動物實驗結果
(1)黃芩苷預處理減少再灌注后心肌梗死面積。AAR/LVd在各組間經Levene方差齊性檢驗,發(fā)現方差不齊(P=0.001),采用Welch法進行近似方差分析。AAR/LV比值在vehicle組和黃芩苷組(
10、100 mg/kg)幾乎相等,表明心肌缺血范圍在這兩組間相似(P=0.425)。INF/AAR經Levene方差齊性檢驗,方差不齊(P=0.006),采用Welch法進行近似方差分析。黃芩苷預處理組INF/AAR(INF:infarct size)和INF/LV顯著降低(F=203.818,P<0.001 vs.vehicle組)。vehicle組和黃芩苷預處理組,INF/AAR的平均比率分別為47.750±5.481%及21.088±
11、5.874%。
(2)黃芩苷預處理改善心肌I-R后左室功能。左室舒張術內徑LVEDD在各組間經Levene方差齊性檢驗,發(fā)現方差齊(P=0.667);LVESD方差不齊(P=0.044)LVFS方差不齊(P=0.001)。左室舒張末內徑LVEDD在各組間差異無統(tǒng)計學意義(F=0.129,P=0.880)。左室收縮末內徑(LVESD)、LVFS各組問差異有統(tǒng)計學意義(Welch=315.394,P<0.001;Welch=2
12、042.669,P<0.001)。黃芩苷預處理后LVESD同vehicle組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。黃芩苷預處理同vehicle組相比左室短軸縮短率(LVFS)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。
(3)黃芩苷預處理抑制I-R誘導的心肌細胞凋亡。TUNEL經Levene方差齊性檢驗,方差不齊(P<0.001),采用Welch法進行近似方差分析。黃芩苷預處理同vehicle組相比心臟組織中TUNEL陽性細胞核
13、數量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,每組4只小鼠,每只小鼠心臟分別計數10個視野,n=40);免疫組化分析顯示黃芩苷組cleaved caspase-3表達較vehicle組減少(n=3每組);Westernblot分析Levene方差齊性檢驗,方差齊(P=0.094),采用LSD進行組間多重比較。Western blot分析顯示黃芩苷預處理同Vehicle組相比,caspase-3活性降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.011,n=3
14、每組)。
(4)黃芩苷預處理對心肌I-R過程中線粒體形態(tài)的作用。缺血區(qū)線粒體明顯腫脹,表現為面積增大,部分線粒體脊消失,而非缺血區(qū)域線粒體結構致密;正常線粒體可見電子致密的基質和未破壞的線粒體脊,心肌I-R損傷后,損傷的線粒體可見部分線粒體脊斷裂,線粒體基質腫脹,黃芩苷預處理能改善線粒體超微結構損傷。
(5)黃芩苷預處理減輕心肌I-R后線粒體腫脹和線粒體分裂。平均線粒體面積經Levene方差齊性檢驗,方差齊(
15、P=0.378),采用LSD進行組間多重比較。黃芩苷預處理減輕心肌I-R后平均線粒體面積(P<0.01 vs.vehicle組,每組4只,每只觀察10個視野,n=40);線粒體分裂百分比經Levene方差齊性檢驗,方差不齊(P<0.018),采用Welch法進行近似方差分析。黃芩苷預處理減少線粒體分裂百分比(P<0.001 vs.vehicle組,每組4只,每只觀察5個視野,n=20)。
(6)黃芩苷預處理減少心肌I-R后
16、線粒體基質微粒和線粒體周脂滴數。線粒體基質微粒數經Levene方差齊性檢驗,方差不齊(P<0.001),采用Welch法進行近似方差分析。黃芩苷預處理減少心肌I-R后線粒體基質微粒數(P<0.001 vs.vehicle組,n=40每組);線粒體周脂滴數經Levene方差齊性檢驗,方差不齊(P=0.042),采用Welch法進行近似方差分析。黃芩苷預處理減少線粒體周脂滴數(P<0.001 vs.vehicle組,n=20每組)。
17、 (7)黃芩苷預處理在心肌I-R過程中發(fā)揮抗氧化作用。Mn-SOD活性經Levene方差齊性檢驗,方差齊(P=0.432),采用LSD進行組間多重比較。黃芩苷預處理增強心肌中Mn-SOD活性(P<0.001 vs.vehicle組);CAT活性經Levene方差齊性檢驗,方差齊(P=0.894),采用LSD進行組間多重比較。黃芩苷預處理增加心肌中CAT活性(P=0.018 vs.vehicle組);經Levene方差齊性檢驗,方差
18、不齊(P=0.002),采用Welch法進行近似方差分析。黃芩苷預處理降低ROS活性(P=0.003 vs.vehicle組,n=5每組)。
(8)黃芩苷預處理通過靶向PKC beta2保護心肌I-R損傷。免疫組化染色顯示黃芩苷預處理組心肌中PKC beta2表達下調(n=6心臟/組);經Levene方差齊性檢驗,方差不齊(P=0.022),采用Welch法進行近似方差分析。Western blot分析顯示黃芩苷預處理組P
19、KC beta2表達水平降低,同vehicle組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.044,n=3每組);
本研究預實驗數據與結果:
(1)黃芩苷預處理減少心肌梗死面積:vehicle或黃芩苷處理的心臟的AAR/LV比值相當;INF/AAR經Levene方差齊性檢驗,方差不齊(P=0.019),采用Welch法進行近似方差分析。不同劑量的黃芩苷均可減少心肌I-R后心梗面積(50、100或200 mg/kg),黃芩苷
20、(100 mg/kg)(26.483±3.224)較50 mg/kg(39.083±3.596)具有更強的限制梗死面積的作用(P=0.001),而200 mg/kg的劑量同100 mg/kg劑量相比無顯著統(tǒng)計學差異(P=1.000,n=6每組)。
(2)黃芩苷預處理減少心肌I-R損傷后細胞凋亡及LDH水平。TUNEL陽性細胞比率經Levene方差齊性檢驗,方差齊(P<0.001),采用LSD進行組間多重比較。不同劑量黃芩苷
21、預處理均可降低TUNEL陽性細胞比率,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,n=30每組);LDH水平經Levene方差齊性檢驗,方差齊(P=0.813),采用LSD進行組間多重比較。黃芩苷預處理降低再灌注2h后血漿LDH水平,(P<0.001,n=8每組)。
(3)黃芩苷預處理增加再灌注2h后Bcl-2/Bax比值。Bax免疫組化染色結果,黃芩苷組較vehicle組Bax表達降低; Bax及Bcl-2蛋白表達Western
22、blot分析結果經Levene方差齊性檢驗,方差齊(Bax: P=0.192; Bcl-2:P=0.197),采用LSD進行組間多重比較。黃芩苷預處理降低Bax蛋白表達,同Vehicle組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001); Bcl-2免疫組化染色結果,黃芩苷組較vehicle組Bcl-2表達增加,同Vehicle組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001); Western blot分析顯示黃芩苷預處理顯著增加Bcl-2蛋白表達;Bc
23、l-2/Bax比值經Levene方差齊性檢驗,方差齊(P=0.202),采用LSD進行組間多重比較。黃芩苷預處理增加心肌再灌注2h后Bcl-2/Bax比值(P<0.001 vs.vehicle組,n=3每組)。
(4)黃芩苷預處理抑制心肌重構。纖維化面積經Levene方差齊性檢驗,方差不齊(P=0.018),采用Welch法進行近似方差分析。黃芩苷預處理顯著降低心臟纖維化面積(P<0.001 vs.vehicle組,n=7
24、每組);心重/體重比經Levene方差齊性檢驗,方差齊(P=0.070),采用LSD進行組間多重比較。黃芩苷預處理減少心重/體重比(heart/body weight ratio)(P<0.001 vs.vehicle組,n=6每組);橫截面積經Levene方差齊性檢驗,方差不齊(P<0.001),采用Welch法進行近似方差分析。黃芩苷預處理降低心肌細胞橫截面積(P<0.001 vs.vehicle組,n=20每組)。
25、2.細胞實驗結果
(1)胰酶/膠原酶連續(xù)消化法成功獲取SD乳鼠原代心肌細胞:
胰酶/膠原酶連續(xù)多次消化獲得的細胞懸液接種后12h,細胞形態(tài)變?yōu)樗笮位虿灰?guī)則扁平狀,24h后即可看到單個細胞的自發(fā)收縮,繼而細胞逐漸鋪展伸出偽足,形成不規(guī)則的星形,到第4~5天,細胞相互接觸交織成網,形成細胞簇貼壁,按照相同的頻率收縮。
(2)心肌細胞缺氧/復氧模型的評估
本部分實驗重復5次(n=5),采
26、用One-Way ANOVA進行統(tǒng)計分析。細胞凋亡率經Levene方差齊性檢驗,方差齊(P=0.054),采用LSD進行組間多重比較。結果發(fā)現,對照組細胞凋亡率為0.046±0.011,缺氧組細胞凋亡率為0.468±0.039,缺氧/復氧組細胞凋亡率為0.722±0.065。缺氧時心肌細胞凋亡率較正常組增加(P<0.001),恢復氧氣供應后,細胞凋亡率不降反升(P<0.001),說明心肌細胞缺氧/復氧模型成功。此外,我們評估了黃芩苷預處
27、理對心肌細胞缺氧/復氧后心肌細胞凋亡率的影響,結果顯示黃芩苷預處理組細胞凋亡率為0.616±0.036,較缺氧/復氧組降低(P=0.001)。
(3)黃芩苷預處理對心肌細胞缺氧/復氧后細胞活性的影響
本部分實驗重復5次(n=5),經Levene方差齊性檢驗,方差不齊(P=0.029),采用Welch法進行近似方差分析。心肌細胞缺氧后活性顯著降低,為41.840±1.412(P<0.001 vs.Control
28、組),而復氧后心肌細胞活性增加,為64.760±3.371(P<0.001 vs.Hypoxia組),我們進一步檢測了黃芩苷預處理對心肌細胞活性的影響,結果顯示黃芩苷組細胞活性為70.660±3.746,因此,黃芩苷可增加心肌細胞活性(P<0.001 vs.H/R組)。
(4)黃芩苷預處理對心肌細胞缺氧/復氧時SOD水平的作用
本部分實驗重復5次(n=5),經Levene方差齊性檢驗,方差齊(P=0.137)
29、,采用LSD進行組間多重比較。心肌細胞缺氧/復氧后SOD水平顯著降低,為105.100±5.001(P<0.001 vs.Control組),我們進一步檢測了黃芩苷預處理對SOD活性的影響,結果顯示黃芩苷組SOD活性為122.600±6.006,因此,黃芩苷可增加心肌細胞缺氧/復氧后SOD活性(P<0.001 vs.H/R組)。
(5)黃芩苷預處理對心肌細胞缺氧/復氧時LDH水平的作用
本部分實驗重復5次(n
30、=5),經Levene方差齊性檢驗,方差齊(P=0.267),采用LSD進行組間多重比較。心肌細胞缺氧/復氧后LDH水平升高,為26.800±0.809(P<0.001 vs.Control組),我們進一步檢測了黃芩苷預處理對LDH活性的影響,結果顯示黃芩苷組LDH活性為22.200±1.666,因此,黃芩苷可降低心肌細胞缺氧/復氧后LDH水平,同H/R組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。
結論:
這些
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