miR-92a在糖尿病勃起功能障礙大鼠中的作用及機(jī)制初探.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 糖尿病ED大鼠模型的建立
　　目的:建立PDE5i治療效果不佳的糖尿病ED大鼠模型
　　方法:采用腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠，10周后，對存活的糖尿病大鼠進(jìn)行阿撲嗎啡（APO）篩選實(shí)驗(yàn)。以大鼠陰莖體增長、露出作為勃起功能良好的標(biāo)志，即APO(+)；反之，為APO(-)。隨后，對APO(-)和APO(+)糖尿病大鼠進(jìn)行海綿體壓力測定以及PDE5i治療效果的評價(jià)。最后，

2、對APO(-)糖尿病大鼠陰莖組織中NO/cGMP通路、RhoA/Rho激酶通路及細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果:與正常對照大鼠相比，APO(-)糖尿大鼠和 APO(+)糖尿病大鼠勃起功能均明顯降低，但APO(-)糖尿大鼠勃起功能更差。當(dāng)給予APO(+)糖尿病大鼠PDE5i（艾力達(dá)2.08mg/kg，海綿體測壓半小時(shí)前灌胃給予，相當(dāng)60 kg成人20mg的等效劑量）治療后，其勃起功能明顯改善，基本上可以達(dá)到正常水平，而APO(-)糖尿

3、病大鼠對PDE5i治療的反應(yīng)性差，盡管海綿體內(nèi)壓有所提高，但仍遠(yuǎn)低于正常水平。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)APO(-)糖尿病大鼠陰莖組織中 P-eNOS/eNOS明顯下降， ROCK2表達(dá)水平和P-MYPT1/MYPT1明顯上升，且凋亡細(xì)胞顯著增多。
　　結(jié)論:阿撲嗎啡實(shí)驗(yàn)可成功篩選出對PDE5i治療效果不佳的糖尿病ED大鼠。
　　第二部分 糖尿病ED大鼠陰莖組織內(nèi)miRNAs表達(dá)譜分析及驗(yàn)證
　　目的:篩選出可能與糖尿病大鼠勃起功能

4、相關(guān)的重要miRNAs
　　方法:提取糖尿病ED大鼠（APO(-)糖尿病大鼠）陰莖組織RNA，采用Agilent Rat miRNA V18.0芯片，對已知的677個(gè)miRNAs進(jìn)行檢測。采用Real-time PCR，對差異顯著的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)檢測其下游靶基因的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:在APO(-)糖尿病大鼠陰莖組織中，3個(gè)miRNAs變化明顯（下調(diào)1/3以上或上調(diào)至少3倍，P＜0.05 vs正常對照組，

5、且探針平均信號值大于4）。其中，miR-133b表達(dá)明顯下調(diào)，miR-92a和miR-29b表達(dá)明顯上調(diào)。采用Real-time PCR方法，發(fā)現(xiàn)miR-133b表達(dá)下降，miR-92a和miR-29b表達(dá)上升，與miRNA芯片結(jié)果一致，同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-92a在陰莖海綿體、主動(dòng)脈、大腦、腎臟、心臟和肝臟中均有表達(dá)。與其他組織和器官相比，miR-92a在陰莖組織中表達(dá)豐度相對較低。進(jìn)一步對miR-92a的下游靶基因進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)eN

6、OS和DKK3的mRNA表達(dá)水平在APO(-)糖尿病大鼠陰莖組織中明顯下降，而CD49e、klf2和klf4的mRNA表達(dá)水平無明顯變化。
　　結(jié)論:miR-92a在糖尿病ED大鼠陰莖組織中高表達(dá)可能與eNOS和DKK3的表達(dá)水平下調(diào)相關(guān)。
　　第三部分 高糖環(huán)境下主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中miR-92a及其靶基因的表達(dá)變化研究
　　目的:在體外水平研究高糖對內(nèi)皮細(xì)胞中miR-92a及其靶基因的表達(dá)變化
　　方法:采用貼壁

7、法培養(yǎng)原代大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，在高糖環(huán)境下培養(yǎng)后，提取主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞RNA，對miR-92a、eNOS和DKK3的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。同時(shí)，提取內(nèi)皮細(xì)胞蛋白，對eNOS和DKK3的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。在高糖培養(yǎng)下，給予miR-92a拮抗劑antagomir-miR-92a后，提取主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞RNA和蛋白，檢測eNOS和DKK3的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:在高糖環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)和72小時(shí)后，miR-92a的表達(dá)水平在主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中

8、均明顯上調(diào)，且呈遞增趨勢；eNOS和DKK3的mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)，且呈遞減趨勢。同時(shí)，eNOS和DKK3的蛋白表達(dá)水平在高糖刺激72小時(shí)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中明顯降低。當(dāng)使用 antagomir-miR-92a預(yù)處理主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞后，在高糖環(huán)境下培養(yǎng)72小時(shí)后，與對照組（antagomir-miR-NC）相比，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS和DKK3蛋白表達(dá)水平明顯升高。
　　結(jié)論:主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中miR-92a在高糖環(huán)境下表達(dá)上調(diào)

9、，進(jìn)而抑制eNOS和DKK3表達(dá)。
　　第四部分 miR-92a-inhibition對糖尿病ED大鼠勃起功能的作用及機(jī)制初探
　　目的:】拮抗miR-92a是否可以改善糖尿病ED大鼠勃起功能及初步機(jī)制的探索
　　方法:以慢病毒為載體，構(gòu)建表達(dá)與 miR-92a序列互補(bǔ)的miR-92a-inhibition（Lv-miR-92a-inhibition）。用貼壁法培養(yǎng)原代大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，主動(dòng)脈細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lv-miR-9

10、2a-inhibition后，檢測eNOS和DKK3的表達(dá)水平。鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠后，采用阿撲嗎啡實(shí)驗(yàn)篩選出 APO(-)糖尿病大鼠。向 APO(-)糖尿病大鼠陰莖海綿體內(nèi)局部注射 Lv-miR-92a-inhibition，治療2周后，采用電刺激海綿體神經(jīng)測定大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓，評價(jià)勃起功能。留取大鼠陰莖組織后，對eNOS和DKK3的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的miR-92a-inhibitio

11、n，當(dāng)其轉(zhuǎn)染主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞96小時(shí)后，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS和DKK3的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。向APO(-)糖尿病大鼠注射Lv-miR-92a-inhibition2周后，其勃起功能明顯改善。初步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)Lv-miR-NC-inhibition治療后，APO(-)糖尿病大鼠陰莖組織中eNOS蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，接近于正常水平，同時(shí)DKK3蛋白表達(dá)水平也明顯上調(diào)，但低于正常水平。
　　結(jié)論:miR-92a-inh