人直腸癌組織勻漿上清對樹突狀細胞的內皮化影響.pdf

1、樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是目前所知的機體內功能最強的專職性抗原提呈細胞，是機體細胞免疫反應的始動者，在腫瘤免疫應答的誘導中具有獨特的地位。而在體內，腫瘤組織通過分泌抑制性細胞因子營造特殊的微環(huán)境來影響樹突狀細胞的功能，從而逃脫機體的免疫監(jiān)視。探討腫瘤環(huán)境下樹突狀細胞的功能及作用將是一個新的研究熱點。最近George Coukos等研究發(fā)現，腫瘤浸潤樹突狀細胞前體在VEGF-A的影響下，發(fā)生內皮細胞化，參與了腫瘤微

2、血管的形成，從而促進了腫瘤的生長、擴散、轉移。 研究目的 本實驗研究直腸癌腫瘤微環(huán)境對DC的功能和細胞表型的影響，在體外利用直腸癌勻漿上清液作為人外周血來源的DC培養(yǎng)的誘導分化劑，來觀察DC內皮化等表型變化的現象，探討腫瘤血管發(fā)生的新機制，為腫瘤治療提供一種新的治療靶點和治療思路。 實驗方法 1.免疫組化檢測腫瘤微血管處S-100蛋白的表達免疫組化SABC法對10例直腸癌及癌旁組織切片進行檢測，來觀察腫瘤

3、組織微血管壁及微血管旁有無S-100蛋白的表達，因S-100蛋白可作為樹突狀細胞的一種特異性標記分子，可以間接推測腫瘤環(huán)境中DCs是否參與了腫瘤微血管的形成。 2．ELIISA檢測勻漿上清液VEGF-A的含量將腫瘤組織200mg：1ml生理鹽水的比例制成腫瘤組織勻漿，用ELISA方法檢測癌及癌旁勻漿上清中VEGF-A活性因子含量的差異。 3．直腸癌勻漿上清對樹突狀細胞表型的影響從外周血來源的單核細胞來培養(yǎng)樹突狀細胞，在D

4、C發(fā)育的早期加入勻漿上清誘導其內皮化。樹突狀細胞在培養(yǎng)至第7d前，可視為未成熟狀態(tài)。因此設第3d癌上清加入組，第3d癌旁上清加入組；第7d癌上清加入組，第7d癌旁上清加入組；并設未加上清的正常培養(yǎng)組作對照。 4．流式細胞學檢測培養(yǎng)細胞CD1a/CD31，CDlaJCD34雙陽性的表達FACS Calibar檢測，Cellquest分析軟件分析檢測結果。 5．免疫細胞化學檢測培養(yǎng)細胞vWF的表達對培養(yǎng)細胞進行單細胞懸液涂片

5、，觀察內皮性標記分子vWF的表達情況。 6．統計分析 采用SPSS10.0統計軟件包進行統計學分析，計量資料用x±s表示；兩組之間比較采用t檢驗；兩組以上均數的比較采用單因素方差分析(ANVOA)；以α=0.05為檢驗水準。 實驗結果 1、S-100蛋白的表達腫瘤微血管旁和血管壁可發(fā)現S-100蛋白的表達，但數量較少，未進行統計學處理。 2、ELISA檢測勻漿上清VEGF-A含量癌及癌旁勻漿上清液

6、里活性因子測定顯示，與癌旁勻漿上清相比，癌上清里活性因子VEGF-A的濃度明顯高于對照組，兩組之間的差異具有顯著性(P<0.05)。 3、CD31，CD34、CD1a等標記分子的動態(tài)表達情況未加入腫瘤勻漿上清液的正常培養(yǎng)的樹突狀細胞，動態(tài)觀察第1d、3d、7d、10d、14d時CD31，CD34，CD1a等標記分子的表達水平，結果顯示：CD31和CD34隨培養(yǎng)時間延長表達逐漸下降，CD1a在1-7d過程中表達逐漸升高，7-14d

7、過程中表達則變化不大。 4、勻漿上清對DC內皮化的誘導效應第3d力口入各組間比較顯示：癌上清及癌旁上清組CD1a/CD31、CD1a/CD34雙陽性的表達率均高于正常對照組，且差異具有顯著性(p<0.05)； 第7d加入各組間比較顯示：癌上清及癌旁上清組的CDla/CD31、CDla/CD34雙陽性的表達率也高于正常對照組，且差異具有顯著性(p<0.05)； 第3d加入各組CDla/CD31，CDla/CD34雙

8、陽性表達率均高于其相對應的第7d加入的各組，且差異具有顯著性(p<0.05)。 癌上清組CDla/CD31，CDla/CD34雙陽性表達率略高于癌旁上清組相比，但差異不顯著(p>0.05)。 5、培養(yǎng)細胞vWF的表達癌上清組和癌旁上清組培養(yǎng)細胞開始表達vWF內皮性標記分子，與正常組相比，差異具有顯著性(p<0.05).癌與癌旁上清組相比，差異不顯著(p>0.05)。 實驗結論 1、在直腸癌腫瘤微血管壁及血