SPLUNC1相關差異miRNA的功能及分子網(wǎng)絡調控機制分析.pdf

1、鼻咽癌是一種在中國雨邵和東南亞地區(qū)高發(fā)的多基因遺傳性惡性腫瘤。SPLUNC1基因是我室克隆的鼻咽癌候選抑瘤基因，它在鼻咽正常組織中高表達，而在鼻咽癌細胞系和組織中低表達。我室前期研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1蛋白是一種細胞表面的分泌性蛋白，它不僅能夠通過結合細菌脂多糖與革蘭氏陰性菌相結合，還能夠抑制EB病毒。說明SPLUNC1可能是一種天然免疫保護分子。我室還克隆了多個候選鼻咽癌抑瘤基因，比如BRD7，NGX6，UBAP1，LPLUNC1，NA

2、G7等，長期以來，我們都是用單基因轉染的方法來研究它們抑制鼻咽癌的機制，但這些抑瘤基因是如何共同作用來阻止多基因遺傳性腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制還不為人知。miRNA是近年來生命科學的熱點，它是一種內源性調控轉錄后信使RNA的小分子RNA，由于miRNA對其數(shù)以百計的靶基因的調控使miRNA與信使RNA之間組成了復雜的調控網(wǎng)絡。正是miRNA調控多基因的這一特點，也許能幫助解決我們多個抑瘤基因共同作用機制的疑問。為了了解SPLUNC1與miRN

3、A在鼻咽癌中調控的分子機制，我們進行了如下研究，并取得了相應的結果：[has-mir-141與has-mir-205在SPLUNC1轉染細胞系中表達下調] 我們將含有全長的SPLUNC1基因的載體轉染至高侵襲，高轉移性鼻咽癌細胞系5-8f中，并建立了穩(wěn)定轉染的細胞系。我們利用博奧生物有限公司開發(fā)的針對435個人(包含Nature雜志預測的有122個miRNA)、196個大鼠、261個小鼠成熟miRNA的哺乳動物miRNA芯片分析

4、了轉染SPLUNC1與其空白對照組的miRNA的差別。結果轉基因組和對照組相比，共有25種miRNA表達明顯上調，(fold change>3)29種miRNA表達明顯下調。(fold change>3).其中兩種強烈下調的miRNA(fold change>10)，has-mir-141與has-mir-205通過northernblot和Q-PCR驗證，確定確實在在SPLUNC1轉染細胞系中表達下調。隨后通過顯微切割10例鼻咽癌組織

5、和10例正常對照鼻咽組織進行Q-PCR驗證，我們發(fā)現(xiàn)hsa-mir-141在鼻咽癌組織中的表達略強于鼻咽組織對照，兩者之間的差異存在統(tǒng)計學意義，而has-mir-205表達則沒有差別。 通過細胞生物學實驗證實has-mir-141和has-mir-205在鼻咽癌細胞系中起著瘤基因的作用. 對特定miRNA的相關細胞生物學功能的研究通常是通過脂質體轉染它的成熟體(mimics)與抑制子(inhibitors)進入相應細胞，

6、人為改變細胞內相應miRNA的含量，達到上調和下調細胞內miRNA的表達的作用進而研究這一系列改變對細胞生長，運動功能，穿膜能力，凋亡，細胞周期等功能的影響。MTT實驗顯示通過轉染hsa-mr-141與hsa-mir-205的成熟體(mimics)與抑制子 (inhibitors)及其相對應的成熟體對照(NC)抑制子對照(INC)，在實驗的前三天各轉染組之間沒有明顯差別，第四天以后，hsa-mir-141抑制子組(inhibit

7、ors)較其他對照組生長速度減慢了30％左右，而hsa-mir-205成熟體(mimics)組較其他各對照組生長速度提高了40％左右。由于5-8f細胞是一種高侵襲，高轉移性腫瘤細胞，我們想知道m(xù)iRNA對細胞這一特性的影響。通過細胞劃痕實驗，我們發(fā)現(xiàn)hsa-mir-141和hsa-mir-205的成熟體組(miniics)均能顯著促進5-8f細胞劃痕傷口的愈合，而hsa-mir-141的抑制子組(inhibitors)則明顯能減緩5-8

8、f細胞劃痕傷口的愈合；而通過transwell實驗我們發(fā)現(xiàn)hsa-mir-141與hsa-mir-205的抑制子組(inhibitors)能明顯降低5-8f細胞穿膜能力。流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)抑制hsa-mir-141和hsa-mir-205能促進細胞凋亡，并能將5-8f細胞阻滯于G1到S期之間。通過western blot對細胞周期相關的一些分子進行檢測，我們發(fā)現(xiàn)顯示hsa-mir-205與141抑制子(inhibitors)均能促進ca

9、spase8與caspase3的表達達到促進凋亡的目的，同時它們同時具有促進JNK2及NF-кB P65表達，并抑制Iкα的表達。這些結果冰明hsa-mir-205與141抑制子能夠通過影響MAPK通路和TNFR通路的相關分子達到阻滯細胞周期的作用。 has-mir-141與has-mir-205所預測的靶基因與SPLUNC1轉染影響的差異mnRNA基因多位于相同的腫瘤調控通路. 我們對轉染SPLUNC1的差異miRNA

10、 has-mir-141和has-mir-205進行了靶基因預測，分別通過在線軟件pictar，targetscan4.0進行預測。隨后我們運用在線基因功能分析軟件DAVID200.FunctionalAnnotation Bioinformatics Microassay Analysis Tools對hsa-mir-141與hsa-mir-205所預測的靶基因進行功能歸類和信號通路分析，發(fā)現(xiàn)它們的靶基因涉及到MAPK，JAK-STA

11、T，Cell cycle，wnt，tightjunction，Adherens junction等多條與腫瘤調控細胞凋亡等功能相關通路。由于hsa-mir-141與hsa-mir-205在鼻咽癌細胞相對低表達，所以我們考慮它們在通路中主要影響抑瘤基因，我們發(fā)現(xiàn)了其中一些具有研究價值的抑瘤基因：MAP2K4，MAP3K3，DLC1，TP53BP2等。更讓我們感興趣的是，我們在has-mir-141的靶基因中發(fā)現(xiàn)了同屬我室克隆的抑瘤基因UB

12、AP1。隨后通過安捷倫全基因組芯片The WholeHuman Genome Oligo Microarray分析SPLUNC1轉染對鼻咽癌細胞系mRNA水平的影響，我們發(fā)現(xiàn)轉基因組與空白組比較上調明顯(FOLDchange>2)的有1698個基因，轉基因組與空白組比較下調明顯(FOLDchange>2)的有2135個基因。通過對轉染SPLUNC1的差異miRNA的預測靶基因和全基因組芯片上下調的差異基因進行比較對接，我們發(fā)現(xiàn)它們之間完

13、全意義的一對一重合幾乎沒有。但運用安捷倫的差異基因通路分析軟件，我們對SPLUNC1轉染的差異基因對涉及到的細胞通路進行了歸類和分析。我們發(fā)現(xiàn)SPLUNC1轉染差異基因的通路分布狀況和hsa-mir-141與hsa-mir-205所預測靶基因的通路分布極為相似，比如其中的MAPK，JAK-STAT，Cell cycle，wnt通路等。提示我們SPLUNC1基因影響這些腫瘤相關通路不僅可以自身直接調控，也可以通過調控miRNA來間接實現(xiàn)。

14、 has-mir-141能通過直接作用UBAP1基因3’非編碼區(qū)調控UBAP1蛋白的表達. 我們將構建好的質粒與相應miRNA mimics或inhibitors共同轉染至5-8f細胞內，通過熒光素酶檢測，我們發(fā)現(xiàn)has-mir-141 mimics對UBAP1空白報告質粒組及UBAP1突變體組無明顯影響，但對插入了UBAP13‘UTR片段的報告質粒組熒光素酶強度下降了50％，(圖3-606)說明UBAP1確實受hsa-

15、mir-141直接影響，即UBAP1為hsa-mir-141的靶基因。通過western blot驗證，結果表明UBAP1在5-8f及對照中低表達，在抑制hsa-mir-141和SPLUNC1轉染細胞系中表達明顯增強。這一結果不僅表明has-mir-141能影響UBAP1蛋白，而且說明SPLUNC1能通過下調has-mir-141來達到上調UBAP1共同發(fā)揮抑制鼻咽癌腫瘤的作用。 [總結] 前期研究表明SPLUNC1轉染

16、不僅影響MAPK通路中關鍵分子如JNK2，NF-кB等，也影響TNFR通路中的caspase3和caspase8進而導致細胞的凋亡和細胞周期的改變。我們通過western blot發(fā)現(xiàn)抑制hsa-mir-141有著同樣的功能和作用，SPLUNC1轉染引起hsa-mir-141與hsa-mir-205下調，而hsa-mir-141不僅可以影響MAPK通路的關鍵分子，也可以通過上調鼻咽癌候選抑瘤基因呢UBAP1，通過其對腫瘤發(fā)生的關鍵蛋白的