體外研究乳酸桿菌對幽門螺桿菌SS1株生長及其誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞急性炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、幽門螺桿菌．(Helicobacter pylori，H．pylori)通過黏附作用、毒力因子對黏膜細(xì)胞的直接損傷以及由機(jī)體對細(xì)胞的免疫反應(yīng)而導(dǎo)致的免疫／炎癥性組織損傷等而致病，與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌及胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤(MALT)等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。普遍認(rèn)為H．pylori[~作用首先是與胃黏膜上皮細(xì)胞黏附，然后胃上皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞骨架重組、酪氨酸磷酸化，進(jìn)而激活NF-κB和(或)絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)，誘導(dǎo)前炎

2、性細(xì)胞因子如IL-8的生成。近年來以乳酸桿菌為主的益生菌在H．pylori相關(guān)胃黏膜炎癥中的作用備受關(guān)注。研究表明，乳酸桿菌可以通過抑制H．pylori的定植，分泌乳酸和抗菌肽類物質(zhì)來抑制和殺滅H.pylori，并可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)而減輕H．pylori的致病性和炎癥程度。乳酸桿菌具有較好的抗H．pylori的應(yīng)用前景，能降低根治H．pylori時抗生素引起的副作用，提高患者的依從性，調(diào)節(jié)菌群失調(diào)，其在H．pylori誘導(dǎo)的胃黏膜炎

3、癥中具有抗炎作用。本課題研究體外嗜酸乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(Lactobacillus acidophilus ATCC4356)、保加利亞乳酸桿菌(L．bulgaricus，LB)對幽門螺桿菌悉尼株(SSl)生長及其誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞急性炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，從細(xì)胞水平探討乳酸桿菌的作用機(jī)制、劑量及應(yīng)用前景。 目的： 1．探討乳酸桿菌對幽門螺桿菌生長的作用及影響。 2．探討兩種乳酸桿菌對SGC7901細(xì)胞的黏附能力以

4、及對H.pylori黏附 SGC7901細(xì)胞的作用及影響。 3．探討乳酸桿菌對幽門螺桿菌誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞NF-KB活化的調(diào)節(jié)作 用。 4．探討乳酸桿菌對幽門螺桿菌誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞分泌IL-8的作用及影響。 5．探討乳酸桿菌對幽門螺桿菌誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用以及探討NF-kB活化、IL-8分泌和細(xì)胞凋亡之間可能的關(guān)系。 實驗材料與方法： 1．以SGC7901細(xì)胞

5、作為H.pylori SSl株感染的體外細(xì)胞模型，選擇華西醫(yī)學(xué)中心公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)檢教研室提供的SGC7901細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，至指數(shù)生長期調(diào)濃度2.5×10<'5>個／ml后種植6孔板，隨機(jī)分組孵育24h， 再以Lactobacillus acidophilus ATCC4356和LB培養(yǎng)至指數(shù)生長期調(diào)不 同濃度與細(xì)胞共育1h后再用H.pylori刺激3h，然后檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析。 2．試驗分組：分為正常對照組(sGC組)、H

6、.pylori刺激組(HP組)、ATCC4356干預(yù)組(ATCC4356組)、保加利亞干預(yù)組(LB組)。 3．直接觀測乳酸桿菌培養(yǎng)上清液對H.pylori平板培養(yǎng)的影響。 4．革蘭氏染色和熒光染色技術(shù)觀察黏附抑制。 5．免疫組化法觀察乳酸桿菌對幽門螺桿菌感染SGC7901細(xì)胞導(dǎo)致的 NF-kB表達(dá)的影響； 6．ELISA法觀察對IL-8分泌量的影響。 7．DAPI熒光染色技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。

7、 結(jié)果： 1．與空白對照組相比ATCC4356和LB兩種乳酸桿菌上清液抑菌環(huán)直徑 有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P<0。01)。 2．兩種乳酸桿菌均能黏附SGC7901細(xì)胞，黏附指數(shù)和細(xì)胞黏附率隨 ATCC4356和LB濃度的升高而升高。在細(xì)菌濃度較低時(3×10<'4>cfu/ml、3×10<'5>cfu／ml)ATCC4356與LB的黏附指數(shù)和細(xì)胞黏附率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，當(dāng)細(xì)菌濃度升高至3x10<'6>cfu

8、／ml、3x10<'7>cfu／ml、3x10<'8>cfu／ml時ATCC4356較LB的黏附指數(shù)和細(xì)胞黏附率明顯升高(P<0.05)。在較高濃度(3x10<'9>cfu／ml)各組之間細(xì)胞黏附率無明顯差別(P>0.05)，但ATCC4356+HP組比ATCC4356組、LB+HP組比LB組的黏附指數(shù) 和乳桿菌黏附率都明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)意義差異(P<0。05)。 3．與空白對照組比較H.pylori誘導(dǎo)的SGC7901

9、細(xì)胞核NF-KBp65表達(dá)陽 性率及IL-8分泌量明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與H.pylori 組比較ATCC4356組在濃度為3x10<'6>cfu／ml、3x10<'7>cfu／ml、3x10<'8>cfu／ml 時干預(yù)能明顯降低NF-kBp65表達(dá)陽性率(P<0.01)。與H.pylori組比 較ATCC4356干預(yù)組在濃度為3x10<'6>cfu／ml、3x10<'7>cfu／ml時能明顯減少 IL-8

10、的分泌量(P<0.01)。與Hp組比較LB組在濃度為 3×10<'6>cfu／ml～3×10<'8>cfu／ml時干預(yù)能明顯降低NF-~Bp65表達(dá)陽性率(P <0.05)。與HP組比較LB干預(yù)組在濃度為3x10<'7>cfu／ml～3x10<'5>cfu／ml時能明顯減少IL-8的分泌量(P<0.05)。但兩種乳酸桿菌濃度過高時 可能無上述抑制作用或相反的增加NF-κBp65表達(dá)陽性率及IL-8的分泌量。 4．與HP組

11、相比較，ATCC4356和LB兩種乳酸桿菌在一定濃度(3×10<'7>cfu／m1)干預(yù)下SGC7901細(xì)胞的凋亡率明顯降低(P<0.01)。 結(jié)論： 1．ATCC4356和LB兩種乳酸桿菌培養(yǎng)的上清液可以直接抑制H.pylori的生長。 2．兩種乳酸桿菌均可以與SGC7901細(xì)胞黏附，并抑制H.pylori黏附SGC7901細(xì)胞，可能是通過與H.pylori競爭SGC7901細(xì)胞膜上的結(jié)合位點發(fā)揮抑制黏附作用的

12、。并且可能并不依賴乳酸桿菌的活性。 3．NF-κB活化參與H.pylori誘導(dǎo)的SGC7901細(xì)胞分泌IL-8，ATCC4356和LB兩種乳酸桿菌可能通過抑制NF-κB活化和減少炎癥因子IL-8的分泌而減輕炎癥反應(yīng)。 4．適當(dāng)濃度的乳酸桿菌在短時間內(nèi)可以抑制H-pylori誘導(dǎo)的SGC7901細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞凋亡率的下降可能與NF-κB活化途徑的抑制有關(guān)。 5．在一定的濃度范圍內(nèi)兩種乳酸桿菌均能抑制H.pylor