Smad信號通路介導BMP-7調控大鼠肝星狀細胞活性.pdf

1、　　目的：研究大鼠肝星狀細胞中Samd1、P-Smad1及纖維化相關基因E-cadherin、α-SMA、col1A2等的表達情況,探討B(tài)MP-7在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中如何拮抗TGF-β1,闡述其抗肝纖維化機制。
　　方法：(1) 體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞(HSC-T6),采用脂質體轉染法將組成性激活化型BMP-7Ⅰ型受體突變體(ALK3-CA)的真核表達載體pcDNA3-HASL-ALK3轉染HSC-T6,用逆轉錄聚合酶鏈反應

2、(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)篩選克隆細胞株；(2) 四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-Dimethyl-thiaoly)-2,5-diphenyl-2H tet razolium bromide, MTT]法檢測高表達持續(xù)活化型ALK3后HSC-T6增殖；(3) RT-PCR檢測col1A2 等基因的mRNA表達；(4)蛋白印跡(Western blott

3、ing,WB)法分別檢測Samd1、P-Smad1、E-cadherin、α-SMA、col1A2的表達；高倍顯微鏡下觀察高表達持續(xù)活化型ALK3克隆細胞株細胞形態(tài)。
　　結果：(1) RT-PCR結果表明陽性克隆株細胞的α-SMA、col1A2、col3A1、col4A2 mRNA表達水平明顯下調,而E-cadherin水平上調。(2) WB結果表明陽性細胞株P-Smad1、E-cadherin表達水平升高,α-SMA、col

4、1A2表達下降,Smad1未見明顯改變,以β-actin作為內參照。(3) MTT法結果表明高表達持續(xù)活化型ALK3能抑制HSC-T6細胞增殖的速度。與0h相比,當培養(yǎng)24h時ALK3-16/T6和對照細胞3.1/T6增殖倍數分別為1.5和2.6倍；當培養(yǎng)48h時,對照細胞增殖倍數為4.3倍,而ALK3-16/T6細胞為1.7倍(*,P<0.05)；隨著時間的延長,ALK3-16/T6細胞增殖速度較對照細胞要慢(*,P<0.05)。因此

5、高表達持續(xù)活化型ALK3受體后可抑制HSC-T6細胞的增殖,并且具有時間依賴性。(4) 倒置顯微鏡下,對照組3.1/T6細胞呈單層生長,細胞多呈梭形排列,胞質薄而透明,核橢圓；ALK3-16/T6細胞成多角形或蝌蚪形,胞質飽滿,核圓大。
　　結論：成功獲得高表達持續(xù)活化型ALK3克隆細胞株,運用實驗室各種技術方法結果提示BMP-7通過增強Samd1磷酸化水平而競爭性拮抗TGF-β1致纖維化作用。BMP-7或者ALK3可作為臨床治