黃芩苷對(duì)小鼠巨細(xì)胞病毒肝炎的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：①在小鼠巨細(xì)胞病毒肝炎模型證實(shí)黃芩苷的治療作用和抗病毒效應(yīng)；②探尋黃芩苷誘導(dǎo)抗CMV 免疫的作用及其可能環(huán)節(jié)和機(jī)制。
　　 方法：⑴黃芩苷的肝毒性實(shí)驗(yàn)：根據(jù)成人的中效劑量計(jì)算小鼠用藥劑量為60 mg/kg，按等倍遞加方式設(shè)計(jì)藥物劑量梯度為60 mg/kg、120 mg/kg、240 mg/kg和480mg/kg。正常小鼠腹腔注射不同劑量黃芩苷，每天1 次，連續(xù)14天后檢測(cè)小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平及肝組織病理變化，觀察黃芩苷肝

2、毒性作用；⑵動(dòng)物模型建立：按照徐翼的方法，選擇4.5周齡BALB/c 小鼠腹腔接種在免疫抑制小鼠體內(nèi)增毒的MCMV Smith 株，建立MCMV 播散性感染模型。在MCMV 接種后24 小時(shí)開(kāi)始給予黃芩苷腹腔注射60mg/kg，每天1 次，共14天；設(shè)立安慰劑對(duì)照組和正常對(duì)照組；⑶肝病變?cè)u(píng)估：于給藥后3、7和14天觀察肝臟組織病變，用肝組織病變活動(dòng)性積分（HAI）評(píng)估肝組織病變，同時(shí)檢測(cè)血清sALT 反映肝細(xì)胞功能變化；⑷病毒學(xué)評(píng)估：用

3、蝕斑法測(cè)定黃芩苷治療14天唾液腺組織內(nèi)感染性病毒量，并與安慰劑對(duì)照組比較；⑸Th1/Th2 類(lèi)細(xì)胞因子表達(dá)：分別于給藥后3、7和14天取小鼠脾細(xì)胞，經(jīng)刀豆素、滅活MCMV 刺激體外培養(yǎng)48 小時(shí)，收集脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用雙抗體夾心ELISA 法檢測(cè)上清中Th1 類(lèi)細(xì)胞因子IFN-γ水平，設(shè)立不加刺激物對(duì)照組。同時(shí)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)小鼠血清中Th2 類(lèi)細(xì)胞因子IL-4水平；⑹Th1和Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子TBX21和GATA-3 蛋白表達(dá)：按

4、上述時(shí)間點(diǎn)提取脾組織蛋白，用Western blot 法檢測(cè)Th1和Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子TBX21和GATA-3表達(dá)強(qiáng)度，設(shè)立內(nèi)參蛋白，以校正值K 進(jìn)行半定量分析。
　　 結(jié)果：①黃芩苷的肝毒性作用：60mg/kg，120 mg/kg，240 mg/kg和480 mg/kg 腹腔注射黃芩苷共14天，未見(jiàn)小鼠死亡，未出現(xiàn)其他異常反應(yīng)。各組小鼠血清ALT水平與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，肝臟切片亦無(wú)明顯異常病理變化；②肝功能改變：

5、與正常對(duì)照組相比，安慰劑對(duì)照組小鼠ALT水平在3天時(shí)明顯升高，7天時(shí)達(dá)高峰，14天時(shí)下降。與安慰劑組相比，黃芩苷治療組ALT水平在3天時(shí)即有明顯下降，7天時(shí)進(jìn)一步下降，14天時(shí)接近正常；③肝組織病理改變：安慰劑對(duì)照組肝組織HAI 均值在第3天達(dá)高峰，以后逐漸下降；黃芩苷治療組肝組織HAI 均值也在第3天達(dá)高峰，但肝損害明顯輕于安慰劑對(duì)照組，以后肝病變逐漸減輕，在第7天和14天時(shí)HAI 均值都顯著低于安慰劑對(duì)照組；④唾液腺感染性病毒量變化

6、：黃芩苷治療14天時(shí)，小鼠唾液腺的感染性病毒量明顯低于安慰劑對(duì)照組；⑤Th1 類(lèi)細(xì)胞因子表達(dá)：黃芩苷治療組和安慰劑對(duì)照組脾細(xì)胞上清中IFN-γ都在7天時(shí)達(dá)高峰，在3天、7天和14天時(shí)都高于正常對(duì)照組水平，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與安慰劑組比較，黃芩苷治療組在3天和7天時(shí)都顯著高于安慰劑對(duì)照組，但到14天時(shí)，黃芩苷治療組已明顯低于安慰劑組；⑥Th2 類(lèi)細(xì)胞因子表達(dá)：安慰劑對(duì)照組3天時(shí)血清IL-4 顯著低于正常對(duì)照組，第7天升至正常水平；到第14天顯

7、著高于正常對(duì)照組。黃芩苷治療組IL-4水平在3天時(shí)亦明顯低于正常對(duì)照組；第7天達(dá)高峰，略高于正常對(duì)照組，但明顯高于安慰劑組；第14天仍略高于正常對(duì)照組，但明顯低于安慰劑組。⑦TBX21 蛋白表達(dá)：安慰劑對(duì)照組3天時(shí)TBX21 蛋白表達(dá)略低于正常對(duì)照組；但7天和14天時(shí)都明顯高于正常對(duì)照組；黃芩苷治療組3天時(shí)TBX21 蛋白表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組及安慰劑組；7天時(shí)達(dá)高峰，14天時(shí)略有下降，亦都明顯高于正常對(duì)照組，但與安慰劑組接近；⑧GAT

8、A-3 蛋白表達(dá)：安慰劑組和黃芩苷治療組3天時(shí)GATA-3 蛋白表達(dá)都顯著低于正常對(duì)照組；但在7天和14天時(shí)都接近正常對(duì)照組表達(dá)水平，而黃芩苷治療組與安慰劑組之間比較無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論：⑴使用高達(dá)8倍中效劑量的黃芩苷對(duì)小鼠肝臟組織無(wú)毒副作用，表明黃芩苷是一種安全的中藥制劑；⑵在整體水平，黃芩苷能顯著減輕MCMV感染所致肝組織病理?yè)p害，促進(jìn)sALT恢復(fù)正常，減少機(jī)體唾液腺內(nèi)感染性病毒量。證明黃芩苷在體內(nèi)具有抗巨細(xì)胞病毒效應(yīng)，