腦苷肌肽注射液誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，也稱骨髓基質(zhì)細(xì)胞，是繼胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞之后，又一種在體內(nèi)外均能向神經(jīng)細(xì)胞分化的干細(xì)胞。具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多向分化的能力，由于其具有取材方便，體外培養(yǎng)容易、易于誘導(dǎo)、易分離擴(kuò)增、自身移植不產(chǎn)生免疫排斥等特點(diǎn)，MSCs成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞治療或基因治療的種子細(xì)胞，是神經(jīng)細(xì)胞移植理想的供體。為了尋找更為理想的誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分

2、化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的藥物及最佳誘導(dǎo)條件，本課題用腦苷肌肽注射液作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以期為MSCs用于神經(jīng)細(xì)胞移植提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 1.取雄性6周SD大鼠，麻醉處死后取雙側(cè)股骨和脛骨的骨髓，用貼壁培養(yǎng)法分離純化骨髓MSCs，傳代、擴(kuò)增，以獲取更純化的MSCs，再連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特性。 2.取生長(zhǎng)良好的2、4、8代細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞種植密度為(4.0×104/ml)，接種于96孔板

3、，每孔250 ul，用唑鹽比色實(shí)驗(yàn)(MTT)法每天固定時(shí)間測(cè)定細(xì)胞的吸光度(OD)值，連續(xù)7d。以時(shí)間(天)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間，并對(duì)三代細(xì)胞的OD值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 3.用誘導(dǎo)劑腦苷肌肽注射液對(duì)MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)。在其他誘導(dǎo)條件不變的前提下，對(duì)比不同濃度的腦苷肌肽注射液對(duì)MSCs誘導(dǎo)后分化為神經(jīng)細(xì)胞比例的影響。按腦苷肌肽注射液的濃度分為以下幾組：1.25 ug/ml，2.5 ug/ml，5 u

4、g/ml，10 ug/ml，20 ug/ml，)于誘導(dǎo)后對(duì)細(xì)胞表達(dá)巢蛋白(Nestine)，膠質(zhì)原性纖維酸性蛋白(GFAP)，神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)的免疫組化的檢測(cè)。計(jì)算陽性細(xì)胞比例，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選出合適的誘導(dǎo)劑量；對(duì)比不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞比例的影響，按誘導(dǎo)時(shí)間分組：(3 d，5 d，7 d，10 d，14d，)通過免疫組化的方法進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算陽性細(xì)胞比例，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，找出合適的誘導(dǎo)時(shí)間。 4 MSCs具

5、有多向分化潛能，為證明我們培養(yǎng)的細(xì)胞具有多向分化潛能，采用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液(10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，10-8mmol/L地塞米松，50 mg/L維生素C，20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)誘導(dǎo)MSCs 2周，行改良Gomori鈣鉆堿性磷酸酶檢測(cè)以鑒定成骨細(xì)胞形成。 結(jié)果： 1.分離得到的單個(gè)核細(xì)胞72 h貼壁，細(xì)胞多呈梭形，多角形，培養(yǎng)10-14 d可達(dá)80％融合。傳代細(xì)胞24 h內(nèi)完全貼壁，細(xì)胞形態(tài)較均一，呈長(zhǎng)梭

6、形，旋渦樣生長(zhǎng)，一般5-8 d內(nèi)可達(dá)80％融合。傳代細(xì)胞生長(zhǎng)較原代要快，7 d即鋪滿培養(yǎng)瓶底，傳代細(xì)胞保持原代細(xì)胞的特征，隨代數(shù)增加，細(xì)胞得到純化，梭形細(xì)胞占到95％以上。 2.不同代骨髓MSCs的生長(zhǎng)曲線第2、4、8代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本相同，呈S形。傳代后第1-2 d為細(xì)胞的生長(zhǎng)滯留期，第3-6 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約第8 d進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞倍增時(shí)間約32 h。方差分析P＞0.05 三代細(xì)胞間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明骨髓MSCs體外穩(wěn)定擴(kuò)

7、增，有很強(qiáng)的增殖能力。 3.腦苷肌肽注射液誘導(dǎo)MSCs為神經(jīng)元樣細(xì)胞用含濃度(1.25-20 ug/ml)的誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，隨腦苷肌肽注射液濃度增高，Nestine、GFAP和NSE陽性細(xì)胞比例也呈現(xiàn)逐步增高趨勢(shì)，經(jīng)免疫組化檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析，腦苷肌肽注射液濃度為(5ug/ml)時(shí)，能夠誘導(dǎo)Nestine、GFAP和NSE陽性細(xì)胞比例為(33.57±0.63)％(61.57±2.45)％、(32.50±0.46)％，顯著高于對(duì)照組

8、P＜0.01。誘導(dǎo)時(shí)間3 d～14d，隨時(shí)間的延長(zhǎng)三種陽性細(xì)胞的比例也呈現(xiàn)逐步增高趨勢(shì)，經(jīng)免疫組化檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析，誘導(dǎo)時(shí)間為10 d時(shí)，能夠誘導(dǎo)Nestine、GFAP和NSE陽性細(xì)胞比例為(34.54±1.01)％、(62.71±0.33)％、(32.19±0.38)％，顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。 4 向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)2周后，實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶染色陽性，對(duì)照組堿性磷酸酶染色為陰性。 結(jié)論 1.實(shí)

9、驗(yàn)中分離培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞樣外觀，具有典型的形態(tài)特點(diǎn)，并證明其可以同時(shí)向神經(jīng)元樣細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，具有多向分化潛能，表明從骨髓分離培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.腦苷肌肽注射液是一種很好的體外誘導(dǎo)劑，可以誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，以5 ug/ml腦苷肌肽注射液作誘導(dǎo)劑，能夠獲得較明顯的誘導(dǎo)的MSCs向神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的結(jié)果，誘導(dǎo)10 d后MSCs能有效向神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分