高通量基因篩選技術(shù)的應(yīng)用及優(yōu)化.pdf

1、研究目的:基因表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，細(xì)胞的生物學(xué)功能是在特定時(shí)間和空間里，多種基因表達(dá)及相互調(diào)控的結(jié)果。明確細(xì)胞在生理與病理?xiàng)l件下的基因表達(dá)及其調(diào)控的差異，將對細(xì)胞生理與病理狀態(tài)的干預(yù)提供極大幫助。隨著測序技術(shù)和基因組學(xué)的不斷發(fā)展，越來越多的高通量基因篩選技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。相比之下，基因表達(dá)序列分析技術(shù)(SAGE)技術(shù)可以將細(xì)胞在特定功能狀態(tài)下全轉(zhuǎn)錄組中每一條mRNA轉(zhuǎn)化為最簡單的10bp的標(biāo)簽形式，并通過后續(xù)的一系列操作對標(biāo)

2、簽進(jìn)行定性定量，具有高通量、高敏感性、可定量和可以發(fā)現(xiàn)新基因的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于特定細(xì)胞在特定功能狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組研究。因此，闡明應(yīng)用SAGE技術(shù)進(jìn)行疾病基因組研究時(shí)的優(yōu)勢和問題，將對未來選擇SAGE技術(shù)進(jìn)行疾病研究具有指導(dǎo)意義。
　　 同種移植排斥是器官移植失敗的主要原因，而CD4+T細(xì)胞在這一過程中具有重要作用。隨著對不同亞群CD4+T細(xì)胞在同種移植排斥或耐受過程中作用研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)單一研究某種基因或目前已知的某類分子已

3、經(jīng)很難解釋各CD4+T細(xì)胞亞型間復(fù)雜的相互作用及它們在移植中的行為方式。非常有必要在基因組水平研究它們彼此之間基因表達(dá)的差異，及其在移植排斥和耐受中基因表達(dá)的特點(diǎn)，因此，在基因組水平發(fā)現(xiàn)更多CD4+T細(xì)胞特異的移植相關(guān)基因?qū)Ψ治霾煌珻D4+T細(xì)胞亞型在移植過程中的作用和相互調(diào)節(jié)具有重要意義。因此，本研究第一部分選擇構(gòu)建同種移植排斥相關(guān)CD4+T細(xì)胞SAGE文庫，并通過該文庫的構(gòu)建分析應(yīng)用SAGE技術(shù)進(jìn)行疾病差異表達(dá)基因研究時(shí)所應(yīng)注意的

4、問題。盡管SAGE技術(shù)已被廣泛用于基因組結(jié)構(gòu)和功能的研究。但是，由于SAGE技術(shù)本身的原因所造成的SAGE標(biāo)簽基因匹配的低特異性使得對標(biāo)簽的基因確定成為SAGE研究的最大難題。盡管后來出現(xiàn)的結(jié)合標(biāo)簽的基因序列延伸技術(shù)(GLGI)將SAGE標(biāo)簽轉(zhuǎn)化為較長的3’EST片段用于cDNA模板的確定，但結(jié)果仍不理想。且這兩種技術(shù)的操作流程非常復(fù)雜，不適合用于大規(guī)模樣本，如腫瘤樣本的研究。因此需要進(jìn)一步探討高通量基因篩選的新技術(shù)，為在基因組水平深入

5、研究疾病基因奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 隨著下一代測序(Next-Generation Sequencing)技術(shù)的出現(xiàn)，已經(jīng)涌現(xiàn)出一些新的基因組學(xué)研究技術(shù)，如雙標(biāo)簽基因組掃描(DGS)技術(shù)，它可以較準(zhǔn)確的在kb分辨率水平發(fā)現(xiàn)正常群體基因組的相似性和差異性，確定病理情況下，如腫瘤基因組的插入、轉(zhuǎn)位、缺失、易位等異常。然而，其復(fù)雜的操作流程卻嚴(yán)重的限制了它在大規(guī)模疾病基因組研究中的應(yīng)用。因此，需要以新的測序儀為平臺，對DGS技術(shù)進(jìn)行改良

6、。課題的第二部分即對原有DGS技術(shù)進(jìn)行改良，相繼建立了改良的體內(nèi)DGS技術(shù)和簡化的體外DGS技術(shù)，旨在為疾病基因組的大規(guī)模研究提供新的高通量基因篩選工具。然而，盡管簡化的體外DGS技術(shù)在實(shí)驗(yàn)流程和基因組檢測效率上有了很大程度的提高，但16bp的可選序列有時(shí)無法提供較好的引物設(shè)計(jì)參考區(qū)域，因而可能影響對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的效率和特異性。為此，論文的第三部分建立了限制性片段全基因組掃描技術(shù)，它是在下一代測序平臺的測序能力進(jìn)一步提高的基礎(chǔ)

7、上產(chǎn)生的，旨在更好的發(fā)揮DGS技術(shù)等末端配對測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)并進(jìn)一步簡化樣本制作過程，使得大規(guī)?；蚪M測序更為常規(guī)化。
　　 研究方法:
　　 第一部分同種移植排斥CD4+T細(xì)胞SAGE文庫的構(gòu)建及分析
　　 本研究應(yīng)用SAGE技術(shù)建立同種移植及同系移植組CD4+T細(xì)胞mRNA標(biāo)簽庫。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定CD4+T細(xì)胞同種移植排斥相關(guān)低拷貝標(biāo)簽，并通過NCBI SAGEmap可信數(shù)據(jù)庫比對和GLGI技術(shù)進(jìn)一步確定同種

8、移植CD4+T細(xì)胞相關(guān)基因。通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR擴(kuò)增部分顯著差異標(biāo)簽，比較兩種方法在發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因方面的敏感性。通過與cDNA微陣列研究結(jié)果的比較，分析SAGE技術(shù)與cDNA微陣列技術(shù)的差異和互補(bǔ)性。
　　 第二部分 DGS技術(shù)的優(yōu)化及應(yīng)用
　　 本研究對原有DGS技術(shù)進(jìn)行改良，相繼建立了改良的體內(nèi)DGS技術(shù)和簡化的體外DGS技術(shù)。改良的體內(nèi)DGS技術(shù)對原DGS流程中后兩步的質(zhì)粒文庫構(gòu)建進(jìn)行改進(jìn)，分別是：1、應(yīng)用M

9、HM pZErO-1質(zhì)粒上的M13引物位點(diǎn)PCR釋放ditags取代原方法中ditags質(zhì)粒擴(kuò)增后酶切釋放ditags。2、用Solexa測序儀直接測序ditags取代原方法中質(zhì)粒擴(kuò)增454測序連接體的步驟。簡化的體外DGS技術(shù)則設(shè)計(jì)了PstⅠ-MmeⅠ-Solexa adaptor，用adaptor與基因組片段的體外連接取代了原DGS技術(shù)中三步質(zhì)粒文庫構(gòu)建過程，通過白血病細(xì)胞系Kasumi-1基因組DNA檢測該技術(shù)的可行性，并成功應(yīng)用

10、簡化的體外DGS技術(shù)制備了8個(gè)家族性乳腺癌患者基因組PstⅠ ditags文庫。
　　 第三部分限制性片段全基因組掃描技術(shù)的建立及其應(yīng)用
　　 計(jì)算機(jī)模擬分析130種限制性酶切位點(diǎn)在人類HG18參考基因組中的分布特點(diǎn)及限制性片段測序全基因組掃描技術(shù)的可行性。應(yīng)用用FatⅠ(/CATG)和Tsp509Ⅰ(/AATT)相繼酶切基因組DNA制備CATG-AATT限制性片段。用T4 DNA聚合酶補(bǔ)平酶切產(chǎn)生的5’凸出粘性末端。應(yīng)

11、用無3’→5’外切酶活性的Klenow片段限制性片段3’末端加“A”。與3’末端含有"T"的Solexa adaptors連接。瓊脂糖凝膠電泳純化連接產(chǎn)物，去掉adaptor自身二聚體。PCR擴(kuò)增adaptor-DNA-adaptor片段。利用adaptor上的測序引物進(jìn)行Solexa測序，每段片段讀取兩端各35～75bp序列。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分同種移植排斥CD4+T細(xì)胞SAGE文庫的構(gòu)建及分析
　　

12、 共得到同種移植組51808個(gè)和同系移植組51644個(gè)標(biāo)簽序列，分別代表同種移植組13726個(gè)和同系移植組13386個(gè)獨(dú)特轉(zhuǎn)錄本。統(tǒng)計(jì)分析確定402個(gè)(拷貝數(shù)均<50)明顯差異表達(dá)(p<0.05，差異倍數(shù)>=3)SAGE標(biāo)簽。通過比對NCBISAGEmap可信數(shù)據(jù)庫和GLGI技術(shù)，本研究共確定同種移植排斥和耐受相關(guān)的97個(gè)上調(diào)基因和88個(gè)下調(diào)基因。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證其中5個(gè)基因的表達(dá)差異特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)利用該技術(shù)分析同種移植和同

13、系移植組的差異基因表達(dá)趨勢同SAGE結(jié)果相同，但實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)對低拷貝下調(diào)表達(dá)基因的檢測敏感性較差。通過與10個(gè)移植相關(guān)的基因組研究結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)SAGE技術(shù)能夠較全面的發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因，且重復(fù)性較高，能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本剪接體和異構(gòu)體，而cDNA微陣列技術(shù)較SAGE技術(shù)更加特異，二者具有互補(bǔ)性。
　　 第二部分 DGS技術(shù)的優(yōu)化及應(yīng)用
　　 成功創(chuàng)建了基于Solexa和Solid測序技術(shù)的優(yōu)化的體內(nèi)DGS技術(shù)和

14、簡化的體外DGS技術(shù)。與之前基于454測序技術(shù)的體內(nèi)DGS技術(shù)相比，新的DGS技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)原DGS技術(shù)應(yīng)用454測序儀，其測序能力在100Mb水平，簡化的體外DGS技術(shù)應(yīng)用Solexa或SOLiD測序儀，其測序能力在Gb水平。測序能力的提高使得DGS技術(shù)掃描基因組的覆蓋度增加，可以收集更高頻率酶切基因組DNA后產(chǎn)生的ditags從而增加基因組掃描的分辨率，還可以避免454測序時(shí)對均聚物中堿基數(shù)辨識不清的問題。2)454測序技術(shù)

15、每次讀取的DNA序列長度為100～2501bp，要求將大約36bp的ditags串聯(lián)后測序。而Solexa和Solid每讀為36bp，可對體外DGS產(chǎn)生的ditags直接測序，這一改進(jìn)很大程度的簡化了DGS流程。3)用限制性內(nèi)切酶PstⅠ替換之前的SacⅠ和HindⅢ，進(jìn)一步提高了DGS技術(shù)對基因組掃描的覆蓋度和分辨率。4)體外DGS技術(shù)僅需要體外adaptor連接即可完成，將實(shí)驗(yàn)周期由1～2周縮短為1～2天。因此，簡化的流程使得進(jìn)行大

16、規(guī)?；蚪M掃描成為可能。應(yīng)用簡化的體外DGS技術(shù)成功構(gòu)建了8個(gè)乳腺癌Pst1-Solexa-Ditags文庫。測序結(jié)果表明，ditags兩端均包含設(shè)計(jì)PstⅠ-MmeⅠ-Solexa adaptor時(shí)已明確的末端序列"TGCAG"和"TGCAA"，序列長度也與MmeⅠ的酶切特點(diǎn)相符，并完全排除了adaptor二聚體對測序結(jié)果的干擾。表明簡化的體外DGS技術(shù)完全可以用于進(jìn)行大規(guī)模疾病基因組的研究。
　　 第三部分限制性片段全基因組

17、掃描技術(shù)的建立及其應(yīng)用
　　 應(yīng)用人類HG18基因組序列信息為模型，通過計(jì)算機(jī)模擬分析了基于Solexa測序技術(shù)的限制性片段測序全基因組掃描技術(shù)的可行性。結(jié)果顯示限制性片段測序全基因組掃描技術(shù)與目前所用的隨機(jī)片段測序技術(shù)相比，所需的測序規(guī)模更小、數(shù)據(jù)分析更簡單、可以根據(jù)對測序分辨率的需要選擇不同的限制性內(nèi)切酶、并且還可以用于基因組結(jié)構(gòu)的分析及基因組物理圖譜的建立。與之前建立的限制性片段測序的DGS技術(shù)相比，其對基因組掃描的覆蓋度

18、更寬、分辨率更高、樣本制作流程更加簡單，末端配對序列長度較DGS技術(shù)的兩末端序列更易設(shè)計(jì)有效的PCR引物擴(kuò)增變異片段。根據(jù)計(jì)算機(jī)模擬分析結(jié)果，建立了CATG-AATT限制性片段實(shí)驗(yàn)流程，并成功用于Yoruba基因組和兩個(gè)乳腺癌基因組的CATG-AATT樣本制備。
　　 結(jié)論及意義:
　　 1、成功構(gòu)建了同種移植排斥CD4+T細(xì)胞SAGE文庫和同系移植CD4+T細(xì)胞SAGE文庫，豐富了開放的SAGE數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)CD4+T細(xì)胞

19、的相關(guān)信息。應(yīng)用SAGE技術(shù)和GLGI技術(shù)，確定了185個(gè)同種移植CD4+T細(xì)胞相關(guān)的差異表達(dá)低拷貝基因。通過對SAGE技術(shù)在移植領(lǐng)域的應(yīng)用闡明了SAGE技術(shù)在疾病相關(guān)差異表達(dá)基因研究中的優(yōu)勢和問題，對將來選擇SAGE技術(shù)進(jìn)行疾病基因組研究具有指導(dǎo)意義。
　　 2、應(yīng)用Solexa和SOLiD測序原理，成功創(chuàng)建了的簡便、省時(shí)、基因組信息覆蓋量大、分辨率高、計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析簡單的改良的體內(nèi)DGS技術(shù)和簡化的體外DGS技術(shù)，為進(jìn)行大規(guī)

20、模疾病基因組研究提供了更加高效的研究工具。
　　 3、創(chuàng)建了限制性片段測序全基因組掃描技術(shù)。該技術(shù)繼承了末端測序DGS技術(shù)省時(shí)、簡便和數(shù)據(jù)分析簡單的優(yōu)勢，進(jìn)一步簡化了DGS技術(shù)的樣本制作流程，提高了基因組分析的覆蓋度和分辨率，并且可以根據(jù)不同研究要求產(chǎn)生不同的限制性片段，為功能基因組技術(shù)從大型基因組研究中心轉(zhuǎn)移到常規(guī)實(shí)驗(yàn)室奠定了基礎(chǔ)。
　　 創(chuàng)新點(diǎn):
　　 1、成功構(gòu)建首個(gè)同種移植排斥CD4+T細(xì)胞SAGE文庫。

21、以全轉(zhuǎn)錄組mRNA測序的SAGE技術(shù)和GLGI技術(shù)為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)了CD4+T細(xì)胞中大量新的移植相關(guān)基因，豐富了移植排斥相關(guān)基因信息。
　　 2、成功創(chuàng)建了改良的體內(nèi)DGS技術(shù)和簡化的體外DGS技術(shù)，為在kb分辨率水平進(jìn)行大規(guī)模疾病基因組掃描建立了更加高效、簡便的工具，并成功應(yīng)用于8個(gè)家族性乳腺癌患者B淋巴細(xì)胞基因組PstⅠ ditags文庫的構(gòu)建。
　　 3、成功創(chuàng)建了基于Solexa和SOLiD測序原理的限制性片段全基因