多模態(tài)成像納米粒子和探針的研制及靶向hTfR成像的基礎研究.pdf

1、分子影像學是采用影像學技術無創(chuàng)性地對活體內參與生理或病理過程的分子進行可視化檢測，活體狀態(tài)下對分子、基因和細胞的變化進行定性和定量研究的一門科學。磁共振成像(MRI)、活體光學成像及核素顯像是該領域的三大主體技術。核素顯像有一定的輻射損傷，觀察時間有限，應用受限。MRI和活體光學成像，尤其是近年來發(fā)展迅速的近紅外熒光(NIRF)成像更為安全，在疾病的早期診斷和靶向治療、干細胞的標記與活體示蹤等方面應用越來越廣泛。MRI具有時間和空間分辨

2、率高、解剖定位準確的優(yōu)勢，而敏感性相對不足，光學成像雖穿透深度有限，空間定位較差，但卻具實時成像、敏感性高等優(yōu)點。多模態(tài)成像策略，即多種成像模式的結合與優(yōu)勢互補，可解決單一技術的缺陷，是分子影像學未來的發(fā)展方向。制備安全性高、生物相容性好的多功能納米材料及靶向性能高的分子探針是實現活體多模態(tài)成像的有力手段之一，也是目前分子影像學的研究熱點。
　　 第一章磁性-熒光量子點雙功能納米粒子雙標記rMSCs
　　 目的：

3、　　 制備磁性-熒光量子點雙功能納米粒子，一步雙標記大鼠骨髓間充質干細胞(rMSCs)，評價雙功能納米粒子對rMSCs的標記效率、可行性和安全性，探討其用于MRI和光學多模態(tài)成像的應用價值。
　　 方法：
　　 1.利用二氧化硅(SiO2)同時包裹四氧化三鐵(Fe3O4)和碲化鎘(CdTe)，制備磁性-熒光量子點雙功能納米粒子Fe3O4@CdTe@SiO2。
　　 2.使用透射電鏡、振動磁強計和紫外激發(fā)燈等對納

4、米粒子的粒徑、分布、飽和磁化強度和熒光性能等進行表征。
　　 3.通過密度梯度離心+貼壁法獲取rMSCs，體外傳代、培養(yǎng)，并通過慢病毒感染將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因轉導入rMSCs基因組，使其持續(xù)穩(wěn)定表達EGFP。
　　 4.利用鐵濃度為25μg/mL的Fe3O4@CdTe@SiO2與rMSCs共同孵育，通過熒光顯微鏡和普魯士藍染色觀察細胞內雙功能納米粒子，檢測雙標記效率，分光光度計測量細胞鐵含量。以未標記的r

5、MSCs作為對照。
　　 5.采用CCK-8法檢測細胞毒性和增殖能力，臺盼藍拒染測細胞活力，成骨、成脂誘導檢測細胞多向分化能力，評價雙標記對rMSCs生物學特性的影響。熒光顯微鏡和普魯士藍染色觀察誘導分化后Fe3O4@CdTe@SiO2雙標記情況。
　　 6.雙標記后的rMSCs分成不同數量級(3×106-1×103個)，使用臨床1.5T MR掃描儀進行SE T1WI、FSE T2WI和GRE T2*WI成像，測量T2W

6、I和T2*WI不同數量級細胞的信噪比(SNR)，觀察細胞數量與MRI信號變化的關系。
　　 結論：
　　 1.殼核結構的Fe3O4@CdTe@SiO2納米粒子具有超順磁性和熒光雙重特性，可同時對rMSCs進行磁性和熒光雙標記，標記效率高，持續(xù)時間長，細胞毒性低，對rMSCs的生物學特性無明顯影響，在體外誘導分化過程中細胞內納米粒子的熒光和超順磁性仍可持續(xù)3周以上。
　　 2.1.5TMR掃描儀可檢測到Fe3O4@

7、CdTe@SiO2雙標記后細胞的信號變化程度與數量級間存在相關性，有望為MRI和光學多模態(tài)成像示蹤移植后rMSCs提供技術基礎。
　　 第二章磁性-近紅外雙功能探針的構建及HeLa細胞和hMSCs體外多模態(tài)靶向成像
　　 目的：
　　 構建人轉鐵蛋白(Tf)介導的磁性-近紅外熒光(NIRF)雙功能分子探針，靶向標記高表達hTfR的腫瘤細胞(HeLa)和人骨髓間充質干細胞(hMSCs)，探討MRI和NIRF多模態(tài)h

8、TfR靶向成像及對hMSCs靶向示蹤的可行性。
　　 方法：
　　 1.將Tf與NIRF染料cy5.5通過羧氨反應結合，制備Tf-cy5.5，在EDC/sulfo-NHS的催化下，進一步與超順磁性的氧化鐵(IO)相連接，構建磁性-NIRF雙功能分子探針Tf-cy5.5-IO。以人血清白蛋白(HSA)作為對照蛋白，構建對照粒子HSA-cy5.5-IO。
　　 2.通過瓊脂糖凝膠電泳、蛋白-核酸分析儀全波長掃描吸收譜

9、分析、粒度與Zeta電位分析儀以及透射電鏡等確定Tf-cy5.5-IO連接效率，對其粒徑、分布與Zeta電位等理化特性進行表征。
　　 3.通過慢病毒感染將人源化綠色熒光蛋白(hrGFP)基因轉導入hMSCs，使其持續(xù)穩(wěn)定表達hrGFP。Balb/c裸鼠皮下注射5×106個慢病毒感染后的hMSCs，觀察其致瘤性，以等量HeLa皮下注射作為對照。
　　 4.將表達hTfR的HeLa細胞和hMSCs分為4組，即A、未標記細胞

10、組；B、靶向探針組；C、HSA對照組和D、競爭實驗組，對各組細胞進行激光共聚焦掃描、普魯士藍染色、細胞鐵含量測定及流式細胞儀檢測，驗證Tf-cy5.5-IO對hTfR的靶向性。
　　 5.取各組2×105個HeLa細胞和hMSCs，進行體外細胞MRI和NIRF成像，定量檢測R2值和平均熒光強度值的變化率，評價Tf-cy5.5-IO用于HeLa和hMSCs靶向多模態(tài)成像的可行性。
　　 6.采用CCK-8法檢測Tf-cy5

11、.5-IO對兩種細胞的細胞毒性及對hMSCs增殖能力的影響，臺盼藍拒染法測細胞活力，碘化吡啶法測細胞凋亡和周期，對hMSCs進行成骨、成脂和成軟骨誘導檢測細胞多向分化能力，評價雙功能探針對靶細胞生物學特性的影響。
　　 7.將探針標記后的第5代hMSCs、成骨和成脂誘導后的hMSCs分別分為上述4組，進行MRI和NIRF成像，驗證Tf-cy5.5-IO對標記或分化后hMSCs的靶向性。
　　 8.Balb/c小鼠尾靜脈注

12、射Tf-cy5.5-IO后連續(xù)飼養(yǎng)10d，對小鼠進行一般情況觀察、肝腎功能測定和病理學檢查，評價探針對活體小動物的急性毒性作用。
　　 結論：
　　 1.Tf-cy5.5-IO分子探針具有磁性和NIRF雙重特性，能夠特異性識別hTfR靶分子，通過MRI和NIRF成像可實現對高表達hTfR的HeLa細胞和hMSCs體外多模態(tài)靶向成像。
　　 2.探針的細胞毒性低，對腫瘤細胞和干細胞生物學特性未產生負面影響，小鼠活體

13、內應用顯示雙功能探針的生物相容性好，無明顯急性毒性作用。
　　 3.在體外，利用Tf-cy5.5-IO雙功能探針，能夠對hMSCs進行靶向成像，探針對標記后第5代和誘導分化后的hMSCs仍具有靶向性。
　　 第三章hTfR體外多模態(tài)成像及QPCR對照研究
　　 目的：
　　 對不同hTfR表達水平的細胞進行MRI-NIRF多模態(tài)成像，與熒光實時定量PCR(QPCR)檢測所得hTfR靶基因表達情況進行對照研

14、究，客觀評價Tf-cy5.5-IO探針靶向hTfR成像靈敏度。
　　 方法：
　　 1.收集HeLa、hMSCs、U251和HepG2四種細胞，提取基因組RNA，通過QPCR檢測hTfR基因表達的相對水平。
　　 2.Tf-cy5.5-IO探針與四種細胞以相同濃度共同孵育1h后，流式細胞儀檢測細胞cy5.5的平均熒光強度，每種細胞均設未標記細胞組和等量HSA-cy5.5-IO對照粒子組作為對照。
　　 2

15、.等量Tf-cy5.5-IO與四種細胞共同孵育4h后進行細胞的MRI和NIRF成像，定量檢測其R2值和平均熒光強度值的變化率，與QPCR結果對照分析。
　　 結論：
　　 1.Tf-cy5.5-IO分子探針與hTfR結合進行MRI-NIRF靶向成像，在一定程度上可定量反映細胞hTfR基因的表達水平。
　　 2.hMSCs相對高表達hTfR，且MRI-NIRF多模態(tài)靶向成像具有可視性和定量檢測能力，為進一步開展hM