分枝桿菌細胞壁相關毒力基因的分離鑒定和功能研究及噬菌體報告系統(tǒng)在快速檢測結核分枝桿菌藥物敏感性中的應用.pdf

1、結核病是一種對人類健康及社會穩(wěn)定構成嚴重威脅的傳染性疾病。在上個世紀中期，隨著各種抗結核藥物的發(fā)現(xiàn)，人類對于結核病的控制取得了輝煌的成就。但是隨著耐藥結核菌的出現(xiàn)及流行，HIV和結核菌的共感染，結核病這種“白色瘟疫”又有重新抬頭的趨勢。結核分枝桿菌獨特的細胞壁上諸多的毒力相關因子在其致病中起到了重要的作用。篩選出這些毒力相關因子，闡明其代謝途徑及功能可以幫助我們進一步理解結核菌的致病機制，為尋求新的治療結核的手段提供理論基礎。另一方面，

2、傳統(tǒng)的結核分枝桿菌藥物敏感性實驗耗時久，難以對臨床結核病的治療發(fā)揮及時的指導作用，因此開發(fā)一種廉價但快速的結核分枝桿菌藥物敏感性檢測方法對指導耐藥結核病的治療以及控制其傳播具有重要意義。全文分兩部分： 第一部分海分枝桿菌細胞壁毒力相關基因的分離鑒定及其功能研究因生長相對快速、對人體危害小，海分枝桿菌正越來越多的被作為一種研究致病性分枝桿菌的模型。利用MycoMarT7噬菌體轉座系統(tǒng)，我們建立了海分枝桿菌的隨機突變庫。以細菌在固體

3、培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)改變以及顯微鏡下的索狀結構改變?yōu)闃酥?，篩選出兩個索狀結構突變株——02C4和02C10突變株，其插入失活的基因與結核分枝桿菌基因ppsA和mas基因高度同源。ppsA和mas均為結核分枝桿菌細胞壁毒力因子PDIM合成通路上的重要基因。經細胞壁脂質成分的薄層色譜分析證實該兩株海分枝桿菌突變株細胞壁的PDIM均缺失。我們重點研究了02C10 ⊿mas突變株。02C10 ⊿mas在體外環(huán)境中的生長速度與野生株并無差異，掃描電

4、鏡下微觀結構改變不顯著，但是在巨噬細胞內的復制、繁殖受到抑制，注射入斑馬魚腹腔后對斑馬魚的致死力急劇下降，并且不形成肉芽腫病理改變。因此，PDIM對于海分枝桿菌在巨噬細胞以及宿主體內的存活非常重要，這一結論與結核菌中研究結果相一致。本課題利用MycoMarT7噬菌體建立了海分枝桿菌隨機突變庫，以海分枝桿菌為模型篩選出兩個分枝桿菌細胞壁毒力相關基因，并建立了海分枝桿菌的毒力檢測系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)PDIM在海分枝桿菌的致病性中起到重要重要的作用。

5、 第二部分應用噬菌體報告系統(tǒng)檢測結核分枝桿菌藥物敏感性本研究旨在建立快速檢測結核分枝桿菌藥物敏感性的噬菌體報告系統(tǒng)(LRPs)，評估其在檢測異煙肼(INH)，利福平(RFP)，鏈霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)敏感性中的應用價值。 應用LRPs檢測49株WHO質控菌株及57株臨床菌株共計106株轉種的新鮮結核分枝桿菌對四種藥物的敏感性，并與比例法相比較。LRPs與比例法對這四種藥物耐藥檢測的一致率分別為93.4％，96.2

6、％，93.4％和84.9％；以比例法為標準，LRPs對這四種藥物耐藥檢測的敏感度分別為98.0％，96.9％，90.4％和75.0％，特異度分別為89.5％，96.0％，96.3％和87.2％。經配對x<'2>檢驗分析，對于轉種過的新鮮菌株，LRPs與比例法對四種藥物耐藥的檢測結果無統(tǒng)計學差異。隨后，我們應用LRPs直接檢測了157株上海市疾病預防控制中心收集的痰培養(yǎng)菌株的藥物敏感性。結果只有39株的LRPs檢測結果有效，其對INH，R

7、FP，SM和EMB的藥敏檢測結果與比例法的一致率分別為79.5％，87.2％，97.4％和66.7％。重新轉種兩種方法檢測結果不一致的菌株，再次用LRPs法檢測后，LRPs對IRSE四種藥物的藥敏結果與比例法的一致率達到了92.3％，94.9％，97.4％和79.5％。 噬菌體報告系統(tǒng)檢測固體培養(yǎng)基上新鮮的結核分枝桿菌藥物敏感性準確快速、可重復性強。但是對于上海市疾病預防控制中心模式下的痰培養(yǎng)標本的直接檢測有效率不高，錯誤較多，