非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物急性肝功能衰竭模型的建立.pdf

1、肝臟作為人體中最重要的器官之一,承擔(dān)著合成、分泌、代謝、解毒等多種復(fù)雜的功能,各種因?yàn)橐坏┰斐筛渭?xì)胞的大量壞死,將出現(xiàn)肝衰竭,導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂和毒性物質(zhì)的堆積,而這反過(guò)來(lái)又加重了肝細(xì)胞的損傷,影響肝細(xì)胞的再生,形成肝衰竭的惡性循環(huán)。急性肝功能衰竭(acute liver failure ALF)是指由于各種致病因素作用于機(jī)體而導(dǎo)致肝細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)大量壞死或肝功能?chē)?yán)重?fù)p害而引起的臨床綜合征群。臨床上以黃疸迅速增加、進(jìn)行性神志改變,進(jìn)而發(fā)展

2、至肝昏迷狀態(tài),并有出凝血機(jī)制異常、肝功酶學(xué)改變、腎功能衰竭甚至出現(xiàn)多臟器功能衰竭等為主要特點(diǎn)。病情進(jìn)展快、病程兇險(xiǎn)、預(yù)后差死亡率高,存活者往往直接進(jìn)入肝硬化階段。該病一般包括暴發(fā)性肝功能衰竭及亞急性肝功能衰竭。暴發(fā)性肝功能衰竭是指急性肝功能損傷,從開(kāi)始發(fā)病在8周之內(nèi)發(fā)展為出凝血功能異常和肝性腦??；亞急性肝功能衰竭指病人肝功能損傷從開(kāi)始發(fā)病在26周內(nèi)進(jìn)展成為肝性腦病。當(dāng)前報(bào)道的唯一具有較好效果的治療是肝移植,存活率在50％～70％,但是由

3、于供體的短缺和倫理學(xué)等因?yàn)?限制了肝移植的開(kāi)展?；诖朔N前提下,國(guó)內(nèi)外學(xué)者設(shè)計(jì)、構(gòu)建了不同類(lèi)型的人工肝系統(tǒng),希冀借助一種體外的機(jī)械、理化或者生物的裝置,清除患者體內(nèi)蓄積的各種有害物質(zhì),補(bǔ)充必需物質(zhì),改善內(nèi)環(huán)境,暫時(shí)替代衰竭肝臟的部分功能,為肝衰竭患者肝細(xì)胞再生及肝功能恢復(fù)創(chuàng)造條件,或等待供肝進(jìn)行肝移植,從而降低患者病亡率。生物人工肝治療的原理是基于肝損傷的可逆性及肝細(xì)胞的可再生性,希望通過(guò)體外輔助裝置來(lái)暫時(shí)替代衰竭的肝臟功能,從而為肝移

4、植或者肝再生贏得時(shí)間,創(chuàng)造條件[4]。
　　 在臨床研究中,往往因?yàn)椴∏閺?fù)雜、影響因素多、缺乏對(duì)照而難以確切判斷療效。因此,建立理想的ALF動(dòng)物模型,是進(jìn)行ALF研究的基礎(chǔ)。理想ALF動(dòng)物模型的要求1974年Terblanche等提出理想ALF動(dòng)物模型的5個(gè)要求,后來(lái)發(fā)展為6條,即是:可逆性、可復(fù)制性、動(dòng)物死于肝衰、有治療時(shí)間窗、大動(dòng)物模型、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員危害小。其中前4條要求最為重要,而后兩條則有利于模型的廣泛推廣。
　　

5、 在過(guò)去30年中,已發(fā)展了多種動(dòng)物模型,多為急性肝衰竭(FHF)模型,方法主要包括外科手術(shù)、藥物和基因敲除。目前急性肝衰竭的動(dòng)物模型多數(shù)為鼠、豬及犬的模型,與臨床患者臨床表現(xiàn)、生理生化指標(biāo)和病理改變差異較大。與嚙齒類(lèi)、犬類(lèi)動(dòng)物相比,非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(non-human primate,NHP)的生理特征以及免疫系統(tǒng)與人類(lèi)相似,98％的基因與人類(lèi)相同。構(gòu)建非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物猴ALF模型并研究其機(jī)理將為生物人工肝的臨床應(yīng)用提供較好的基礎(chǔ)。

6、　　 研究背景:
　　 急性肝功能衰竭(acute liver failure,ALF)是臨床危重疾患之一,目前的內(nèi)科綜合治療效果不理想,病死率高達(dá)80％左右。當(dāng)前報(bào)道的唯一具有較好效果的治療是肝移植,存活率在50％～70％[3,4],但是由于供體的短缺和倫理學(xué)等因?yàn)?限制了肝移植的開(kāi)展。因此,建立理想的ALF動(dòng)物模型,是進(jìn)行ALF研究的基礎(chǔ)。1974年Terblanche[5]等提出理想ALF動(dòng)物模型的5個(gè)要求,后來(lái)發(fā)展為6

7、條,即是:可逆性、可復(fù)制性、動(dòng)物死于肝衰、有治療時(shí)間窗、大動(dòng)物模型、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員危害小。其中前4條要求最為重要,而后兩條則有利于模型的廣泛推廣。(1)可逆性:采用一定的方法使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生ALF,未經(jīng)治療的動(dòng)物應(yīng)該有較高的死亡率(80％左右)；而治療有效者,肝臟病損能夠可逆地恢復(fù),動(dòng)物得以存活。當(dāng)前使用的一些建立模型方法,如完全阻斷血供造成肝壞死和全肝切除,均造成肝臟產(chǎn)生不可逆性的生物化學(xué)和組織學(xué)改變,故不能建立理想的ALF動(dòng)物模型。(2)

8、可復(fù)制性:理想的ALF動(dòng)物模型應(yīng)該是重復(fù)性、穩(wěn)定性好。目前的建立模型方法一般較難預(yù)測(cè)動(dòng)物的病情程度、存活時(shí)間、昏迷時(shí)間等基本參數(shù)。另外未經(jīng)治療的ALF動(dòng)物應(yīng)該幾乎全部死亡,但在實(shí)驗(yàn)工作中這一基本要求很難做到。(3)動(dòng)物死于肝衰:死亡率是鑒別和觀察療效的終點(diǎn)指標(biāo)之一。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最終應(yīng)該因ALF死亡而不是死于其它因?yàn)?這一點(diǎn)對(duì)于準(zhǔn)確采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),正確判定療效非常重要。(4)有治療時(shí)間窗:從對(duì)動(dòng)物施加損害性處理到動(dòng)物死亡的時(shí)間間隔不應(yīng)該太短,以

9、便有足夠的時(shí)間對(duì)其進(jìn)行干預(yù)并評(píng)估治療效果。(5)大動(dòng)物模型:大動(dòng)物的ALF模型便于連續(xù)地采集血樣或組織進(jìn)行系列性研究,所研究的各種治療方法也希望在與人近似的動(dòng)物上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以便以后直接應(yīng)用于臨床,如當(dāng)前對(duì)生物人工肝支持系統(tǒng)的研究以使用大動(dòng)物模型為宜。(6)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員危害小:所應(yīng)用的任何化學(xué)品應(yīng)該盡量對(duì)實(shí)驗(yàn)人員無(wú)害。但目前使用的某些肝毒性物質(zhì),如四氯化碳、亞硝基胺等,由于對(duì)人體有一定毒性未能達(dá)到此項(xiàng)要求。目前的急性肝功能衰竭動(dòng)物模型多是鼠、

10、豬、犬類(lèi)。與嚙齒類(lèi)、犬類(lèi)動(dòng)物相比,非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(non-human primate,NHP)的生理特征以及免疫系統(tǒng)與人類(lèi)相似,98％的基因與人類(lèi)相同,目前通過(guò)檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)還未見(jiàn)非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物急性肝功能衰竭模型的報(bào)道。因此探索和建立與人類(lèi)相似猴ALF模型就十分必要。
　　 目的:
　　 構(gòu)建一種穩(wěn)定的具有潛在可逆性和良好重復(fù)性的非人靈長(zhǎng)類(lèi)大動(dòng)物急性肝衰竭模型,為了解人ALF的機(jī)制和救治建立基礎(chǔ)。本研究擬在氯胺酮(0.1

11、ml/kg)麻醉?xiàng)l件下,通過(guò)靜脈注射不同劑量的D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-gal)以建立食蟹猴ALF模型,觀察動(dòng)物的臨床、生化及組織學(xué)變化特征,摸索猴ALF合適的D-gal劑量,為下一步探索急性肝功能衰竭的機(jī)制及救治奠定基礎(chǔ)。
　　 材料和方法:
　　 選取雄性食蟹猴作為模型動(dòng)物。預(yù)實(shí)驗(yàn)后將20只食蟹猴隨機(jī)分為4組:第一組為大劑量組(n=5),給藥劑量為0.45g/kg；第二組為中等劑量組(n=5

12、),給藥劑量為0.3g/kg；第三組為低劑量組(n=5),給予D-氨基半乳糖0.15g/kg第四組為對(duì)照組(n=5),不給予D-氨基半乳糖。氯胺酮(0.1ml/kg)肌內(nèi)注射麻醉下,在10min內(nèi)把D-氨基半乳糖溶液經(jīng)頸外靜脈一次性輸入實(shí)驗(yàn)猴體內(nèi)。顱頂鉆一小洞,插入Codman微傳感器測(cè)量顱內(nèi)壓(ICP)的變化。術(shù)后動(dòng)態(tài)觀察生存情況,術(shù)前及術(shù)后每天定時(shí)抽血送南方醫(yī)院檢驗(yàn)科,用于測(cè)定肝功能、腎功能、血糖、血氨、凝血項(xiàng)、支鏈氨基酸和芳香族氨

13、基酸比等。觀察動(dòng)物臨床表現(xiàn)及病程進(jìn)展情況,記錄動(dòng)物存活時(shí)間。死亡動(dòng)物立即尸檢,動(dòng)物死后作詳細(xì)尸檢并取肝臟、腎臟、脾臟、胰腺、心臟、肺、胃腸和腦組織。光鏡標(biāo)本均用10％的甲醛溶液固定,石蠟包埋切片,HE染色,電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和鋨酸雙重固定,樹(shù)脂包埋,醋酸鈾、檸檬酸鉛染色,光鏡及電鏡下觀察上述組織的病理學(xué)變化。
　　 結(jié)果:
　　 第1組的平均存活時(shí)間是(56.1±8.1)h,有4/5的病食蟹猴死亡前出現(xiàn)肝昏迷,不能站立。第

14、2組的平均存活時(shí)間為(109.8±11.2)h,其中3/5的病食蟹猴出現(xiàn)肝昏迷。第3組以劑量為0.15g/kg D-氨基半乳糖胺引導(dǎo)的5只食蟹猴中,除1只98h后死亡外其余全部存活,在第4d開(kāi)始好轉(zhuǎn),之后全部指標(biāo)漸恢復(fù)正常。第2組兩只食蟹猴的存活時(shí)間分別為105和120h,食蟹猴的血壓在給藥后都保持平穩(wěn),顱內(nèi)壓則明顯上升1倍以上,血清的轉(zhuǎn)氨酶在給藥后12h開(kāi)始升高,并隨病程進(jìn)展越來(lái)越高,血中的膽紅素、膽酸、氨、乳酸也逐漸上升。而血小板則

15、越來(lái)越低,凝血酶原時(shí)間越來(lái)越長(zhǎng)。所有實(shí)驗(yàn)食蟹猴的血液電解質(zhì)和酸堿度一直保持在正常的范圍內(nèi)。血?dú)夥治龅慕Y(jié)果也在正常范圍,沒(méi)有明顯的變化。直線相關(guān)分析顯示注射D-gal的動(dòng)物存活時(shí)間與D-gal劑量呈顯著負(fù)相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析表明各組實(shí)驗(yàn)猴生存時(shí)間比較,(x2=21.933,P=0.000)差異有顯著性。尸檢發(fā)現(xiàn)所有給予D-gal的動(dòng)物肝臟體積縮小,邊緣變銳,表面色澤斑駁,散在針尖至米粒大小出血點(diǎn),肝臟切面有暗紅色淤血,黃

16、色乳靡狀壞死物質(zhì)溢出,膽囊形態(tài)、大小正常,腸管有輕度到中度脹氣,腸壁充血水腫,有散在出血點(diǎn),腎臟、脾臟、肺臟肉眼未見(jiàn)異常。腦組織重度水腫,以血管周?chē)g隙與星狀細(xì)胞周?chē)黠@。
　　 光鏡檢查發(fā)現(xiàn)對(duì)照組動(dòng)物肝小葉結(jié)構(gòu)完整,無(wú)肝細(xì)胞壞死征象。而注射D-gal的動(dòng)物均出現(xiàn)肝細(xì)胞片狀壞死,伴有明顯的出血,肝細(xì)胞彌漫性腫脹,肝竇受壓變窄。肝細(xì)胞胞漿疏松化、空泡變性,部分肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)脂肪空泡。部分肝細(xì)胞核碎裂、溶解。部分匯管區(qū)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞和

17、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。0.45g/kg的動(dòng)物肝細(xì)胞呈現(xiàn)大片壞死,肝小葉結(jié)構(gòu)不清,出血嚴(yán)重。電鏡檢查未注射D-氨基半乳糖胺時(shí),肝臟超微結(jié)構(gòu)示食蟹猴肝細(xì)胞胞漿內(nèi)糖原顆粒豐富,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富無(wú)擴(kuò)張,線粒體豐富無(wú)腫脹,嵴清晰,線粒體膜清楚,細(xì)胞核染色質(zhì)均勻,核膜核仁清晰。注射D-氨基半乳糖胺時(shí),細(xì)胞漿內(nèi)糖原顆粒均質(zhì)化,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒,線粒體腫脹,嵴模糊,部分線粒體溶解,細(xì)胞間毛細(xì)膽管微絨毛減少明顯,細(xì)胞核染色質(zhì)集聚,核變形,核內(nèi)假包涵體形成。