消化系疾病病證結(jié)合唾液蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究.pdf

1、目的: 應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)，選擇西醫(yī)病種胃癌（GC）患者、消化性潰瘍（PU）患者及慢性胃炎（CG）患者，根據(jù)舌苔及病證結(jié)合分組，并與同齡正常組對照，進行唾液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，以闡明脾虛證與腎虛證在蛋白質(zhì)組水平上的唾液特異性微觀特

2、征，并應(yīng)用生物信息學(xué)手段篩選證候最優(yōu)化蛋白質(zhì)組合并初步建立脾虛、腎虛病證結(jié)合診斷模型；并從蛋白質(zhì)組水平初步探討中醫(yī)同病異證、異病同證的現(xiàn)代科學(xué)基礎(chǔ)；同時，建立具有中醫(yī)特色的唾液蛋白質(zhì)組無創(chuàng)傷診斷技術(shù)，推動促進微觀辨證學(xué)的發(fā)展和中醫(yī)診斷學(xué)的現(xiàn)代化。 方法: 采集95例唾液標(biāo)本，其中正常對照者20例均為健康體檢正常者，胃癌患者34例，消化性潰瘍患者20例，慢性胃炎患者21例。所有疾病患者均經(jīng)過胃鏡和/或術(shù)后組織病理檢測明確診

3、斷。按病證結(jié)合分為以下三大組：（1）異病異證分組：即以證候為綱進行分組，全部病例按虛證辨證標(biāo)準分為脾虛、腎虛、其他證候3組與正常組進行比較研究。（2）同病異證分組：將胃癌分別按虛證辨證標(biāo)準分為脾虛、腎虛、其他證候3組與正常組進行比較研究。（3）西醫(yī)病種分組：比較正常對照者與3種疾病及疾病之間蛋白質(zhì)表達譜的差異。（4）按不同舌苔分組：比較正常薄白苔與三種病理舌苔之間蛋白質(zhì)表達譜的差異。采用德國BRUKER公司的WCX磁珠及Autoflex

4、Ⅲ MALDI-TOF質(zhì)譜儀對全部患者和正常人的唾液進行蛋白質(zhì)表達譜的檢測。設(shè)定所有唾液樣本檢測的蛋白質(zhì)采集相對分子量范圍為1000～10000Da。所得到的蛋白質(zhì)以肽質(zhì)量指紋圖（PMF）的形式表示。然后使用BRUKER公司的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（其中包括一個配套的標(biāo)峰和校正峰的軟件FlexAnalysis3.0和統(tǒng)計學(xué)分析軟件ClinProTools2.1）對每個組合內(nèi)的相同質(zhì)荷比不同含量的蛋白進行分析比較，找到組合內(nèi)蛋白含量有顯著差異的質(zhì)荷

5、比峰。將組合內(nèi)含量有顯著差異（P<0.05）的蛋白質(zhì)波峰建立分類預(yù)測模型，選擇相應(yīng)條件，用統(tǒng)計分析軟件ClinProTools2.1對其進行分組統(tǒng)計，從而得到各組的特異性蛋白標(biāo)志物并初步建立相應(yīng)疾病、證候及病證結(jié)合的唾液蛋白質(zhì)組診斷模型。用隨機抽樣方法（隨機選擇80%樣本建立模型，其余的20%作為驗證樣本，共運行十次），驗證模型的有效性（平均特異性、靈敏性及平均準確率）。用SPSS13.0軟件進行各組基線值的比較，年齡的比較采用單因素方

6、差分析，所有數(shù)據(jù)用x±s表達，性別構(gòu)成的比較采用X2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1.按異病異證分組：將所有患者分為脾虛、腎虛、其他證候3組加上正常組共79例樣本，對所有的樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析比較，共得到蛋白質(zhì)峰為175個，其中通過遺傳算法找到了10個差異顯著的蛋白峰，其質(zhì)荷比（m/z）分別為：7447.22Da、3963.26Da、7911.59Da、1390.85Da、6574.69Da、1167

7、.54Da、1230.73Da、7846.3Da、2724.41Da、2223.89Da。在此基礎(chǔ)上建立了分類預(yù)測模型，識別率為89.15%，預(yù)測能力38.63%。回代檢驗結(jié)果正常組19例全部被準確檢出，19例脾虛患者，其中16例被準確檢出，21例腎虛患者，有18例被準確檢出，20例其他證候患者，有17例被準確檢出。該模型的準確率為88.61%（70/79）。 2.按同病異證分組：胃癌脾虛、胃癌腎虛、胃癌其他證候3組和正常組共4

8、8例，對樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析比較，共得到蛋白質(zhì)峰為161個，其中通過遺傳算法找到10個差異顯著的蛋白峰，質(zhì)荷比（m/z）：8840.72Da、3442.42Da、4120.81Da、3492.63Da、6558.43Da、5583.29Da、3286.1Da、4419.3Da、5527.57Da、3923Da。通過分析差異蛋白建立了分類預(yù)測模型，識別率為80.97%，預(yù)測能力33.47%：回代檢驗結(jié)果正常組19例，其中17例被準確檢出

9、，10胃癌脾虛患者全部被準確檢出，11例胃癌腎虛患者，其中7例被準確檢出，其他證候組8例，有6例被準確檢出，該模型的準確率為83.33%（40/48）。 3.按西醫(yī)病種分組：①正常對照組與胃癌組兩組樣本共41例，對所有的樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析比較，兩個組共得到蛋白質(zhì)峰為74個，其中14個統(tǒng)計差異顯著的蛋白峰（P<0.05），選擇質(zhì)荷比（m/z）為1472.78Da、2936.49Da、6556.81Da和7081.17Da這四個

10、蛋白質(zhì)峰進行建模。其中發(fā)現(xiàn)胃癌患者1472.78Da峰處顯著高于正常人。通過對這4個蛋白峰的鑒別，建立了分類預(yù)測模型，識別率為97.83%，預(yù)測能力79.82%。臨床回代檢驗結(jié)果，23例胃癌患者中有22例被準確檢出為胃癌，18例正常組中所有18例全部被確定為非胃癌。結(jié)果表明，該診斷模型的準確率為97.56%（40/41），靈敏度為95.65%（22/23）特異度為100%（18/18）。②正常對照組與慢性胃炎組兩組樣本共32例，對所有的

11、樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析比較，兩個組共得到蛋白質(zhì)峰為74個，其中5個有統(tǒng)計差異顯著的蛋白峰（P<0.05），選擇質(zhì)荷比（m/z）為：5502.36Da、1441.75Da和3442.47Da這3個相關(guān)蛋白峰建立分類預(yù)測模型，識別率為91.67%，預(yù)測能力73.33%。臨床回代檢驗結(jié)果14例慢性胃炎患者全部被準確檢出，18例正常組對照者，其中15例被正確檢出，該模型的準確率為90.63%（29/32），靈敏度為100%（14/14），特異度

12、為83.33%（15/18）。③正常對照組與消化性潰瘍組兩組樣本共35例，對所有的樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析比較，兩組共得到66個蛋白質(zhì)峰，其中10個有統(tǒng)計差異顯著的蛋白峰（P<0.05），選擇質(zhì)荷比（m/z）為：2934.36Da、5502.38Da和3472.94Da這3個相關(guān)蛋白峰，通過分析這些差異蛋白表達譜建立了分類預(yù)測模型，識別率為88.40%，預(yù)測能力80.35%。臨床回代檢驗結(jié)果17例消化性潰瘍，其中14例被準確檢出，18例正

13、常組對照者，其中17例被正確檢出，該模型的準確率為88.57%（31/35），靈敏度為82.35%（14/17），特異度為94.44%（17/18）。④慢性胃炎組與胃癌組兩組樣本共37例，對所有的樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析比較，兩組共得到77個蛋白質(zhì)峰，其中1個有統(tǒng)計差異顯著的蛋白峰，質(zhì)荷比（m/z）為：6021.72Da。通過分析這個差異蛋白表達譜建立了分類預(yù)測模型，其識別率為83.54%，預(yù)測能力為60.23%。⑤慢性胃炎組與消化性潰瘍

14、組兩組樣本共29例，對所有的樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析比較，兩個組共得到蛋白質(zhì)峰為79個，運用統(tǒng)計分析軟件ClinProTools得出了最適宜的區(qū)分模式模型，該模型包括了4個相關(guān)峰，質(zhì)荷比分別為：3369.79Da、3472.13Da、2900.2Da和3489.29Da，通過分析這些差異蛋白表達譜，并建立了分類預(yù)測模型，該模型的識別率92.86%，模型預(yù)測能力56.87%。⑥消化性潰瘍組與胃癌組樣本共42例，對所有的樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析

15、比較，兩個組共得到蛋白質(zhì)峰為77個，差異蛋白的分析建模有待進一步進行。 4.按舌苔分組：正常薄白苔與三組病理舌苔（包括病理薄苔、病理厚苔和病理剝苔）共75例，對所有的樣本檢測質(zhì)譜圖進行分析比較，共得到蛋白質(zhì)峰為187個，其中4個有統(tǒng)計差異顯著的蛋白峰（P<0.05），質(zhì)荷比分別為：6447.39Da、2938.47Da、1472.34Da、1451.77Da，通過分析這些差異蛋白峰表達譜，并建立了分類預(yù)測模型，識別率為85.31

16、%，預(yù)測能力39.91%。對正常組19例，有18例被準確檢出，56例病理組，其中40例被準確檢出，該模型的準確率為85.33%（64/75）。 結(jié)論： 本研究利用MALDI-TOF-MS技術(shù)對健康對照組、胃癌組、消化性潰瘍組和慢性胃炎組患者的唾液中的蛋白質(zhì)進行表達譜的檢測，從唾液蛋白質(zhì)組初步篩選出了可用于臨床病證結(jié)合診斷的特異生物標(biāo)記物，并探索建立了相關(guān)病證結(jié)合的診斷模型。該方法與傳統(tǒng)疾病生物標(biāo)志物相關(guān)的檢測方法比較，具