microRNA-17抑制人包皮成纖維細胞衰老的作用及機制研究.pdf

1、細胞衰老(cellular senescence)是細胞進入一種周期不可逆轉的停滯而達到的相對穩(wěn)定狀態(tài)。細胞衰老主要受到p53-p21通路和p16-pRb通路的調控，當這兩條通路中的關鍵調控因子如p21蛋白表達下降或細胞周期蛋白cyclinD的蛋白表達上調時，細胞可以延緩衰老或繞過衰老程序繼續(xù)增殖。
　　miR-17家族，亦可稱為miR-106b家族，是由6個序列相似，結構相仿，種子區(qū)序列相同(AAAGUGCU)，物種間高度保守的

2、成熟體miRNA組成。 miR-17可以通過調節(jié)轉錄調控因子E2F家族和pRb蛋白水平的表達，進而調控細胞周期來影響細胞的增殖生長，提示miR-17在細胞衰老中發(fā)揮重要作用。但是miR-17上游和下游的調控因子和機制還不十分明確。因此研究miR-17調節(jié)細胞衰老的作用與機制，對于研究和治療衰老相關疾病，探索腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機理有著重要意義。
　　研究目的:
　　1.人包皮成纖維細胞（human foreskin fibr

3、oblasts，HFF）體外分離培養(yǎng)、生長與傳代并觀察各代HFF的增殖規(guī)律和特點。
　　2.研究miR-17對HFF細胞衰老的影響。
　　3.明確miR-17對HFF細胞周期的調節(jié)。
　　4.研究miR-17對HFF細胞周期相關蛋白的調控作用。
　　研究方法:
　　1.無菌取7歲患者的手術切除的包皮，利用DispaseⅡ酶消化的方法獲得較高純度的HFF，并進行傳代培養(yǎng)。取第3代HFF，用兔抗人波形蛋白(Vi

4、mentin)單克隆抗體作為一抗，采用免疫組織化學SABC法對細胞進行鑒定。
　　2.慢病毒感染HFF72h后，熒光倒置顯微鏡觀察HFF-miR-17及HFF-NC細胞中GFP的表達，并拍照。利用實時定量PCR技術檢測HFF-miR-17及HFF-NC中miR-17的表達情況。
　　3.通過CCK-8法觀察HFF-miR-17和HFF-NC生長變化，并繪制細胞增殖曲線。衰老相關β-半乳糖苷酶染色法檢測HFF-miR-17和H

5、FF-NC細胞中衰老相關β-半乳糖苷酶的表達情況。
　　4.利用流式細胞術檢測HFF-miR-17與HFF-NC細胞周期的變化情況。利用Westem blotting檢測，空白對照細胞HFF、陰性對照細胞HFF-NC和實驗組細胞HFF-miR-17中p21和cyclinD1蛋白表達水平。
　　研究結果:
　　1.采用SABC法對細胞行免疫化學染色，實驗組用兔抗人波形蛋白單克隆抗體作為一抗，顯微鏡下觀察可見，細胞呈長梭形

6、或多角形，細胞胞漿呈棕色染色，提示其為HFF細胞。
　　2.慢病毒感染HFF72h后，熒光顯微鏡下檢測到綠色熒光分布于細胞內，與光學顯微鏡下同一視野對比，熒光示感染效率達90％，提示感染成功。慢病毒感染HFF72h后，利用實時定量PCR技術檢測到感染了Lenti-miR-17的細胞與感染了Lenti-NC的細胞相比，miR-17表達明顯上調，二者差異具有統計學意義(P＜0.05)。
　　3.通過CCK-8法觀察HFF細胞生長

7、的變化。與陰性細胞HFF-NC相比，穩(wěn)定表達miR-17的HFF-miR-17細胞在450nm處的吸光度值連續(xù)六天均明顯升高，其差異具有統計學意義(P＜0.05)，表明miR-17能夠促進HFF細胞的增殖能力。
　　4.對細胞進行衰老相關β-半乳糖苷酶染色，HFF-miR-17細胞顯示出較弱的衰老相關β-半乳糖苷酶染色，不到1％的細胞被染成藍色，提示此時細胞為正常細胞;而對照細胞HFF-NC中有高達20％的細胞被染成藍色，表明細胞

8、已衰老，提示miR-17的表達顯著抑制了細胞的衰老。
　　5.利用流式細胞術檢測細胞周期，結果顯示HFF-miR-17細胞與對照HFF-NC相比，停滯在G1期的細胞明顯減少(81.5％ vs72.6％);用DNA破壞物質Bleomycin處理細胞后，72.9％的HFF-NC細胞停滯在G1期，僅有2.5％的HFF-NC細胞能夠越過G1期進入S期，而HFF-miR-17細胞停滯在G1期的比例顯著減少(54.6％)，進入S期的增多(10

9、.2％)，說明miR-17促進細胞進入S期進行增殖且能越過藥物誘導的G1 arrest。另外所有流式結果圖中均沒有出現凋亡峰，說明miR-17不是通過抑制細胞的凋亡促進細胞增殖的。
　　6.Westem blotting檢測顯示，與空白對照HFF細胞和陰性對照細胞HFF-NC相比，p21蛋白表達水平在HFF-miR-17中下調，而cyclinD1蛋白表達水平顯著升高，說明miR-17能夠通過調控p21和cyclinD1蛋白表達水平

10、，促進原代細胞的增殖，抑制原代細胞的衰老。
　　研究結論:
　　1.利用DispaseⅡ酶消化的方法能獲得較高純度的HFF，并首次用慢病毒感染系統成功構建了在人包皮成纖維細胞中穩(wěn)定表達miR-17的細胞系。
　　2.miR-17能夠抑制HFF細胞的衰老。
　　3.miR-17能夠促使HFF由G1期進入S期，促進細胞的增殖。
　　4.miR-17能夠調控HFF中p21和cyclinD1蛋白表達水平，促進原代細