關節(jié)腔內注射逆轉錄病毒載體介導的重組人IL-1Ra和TGF-β1基因治療兔膝骨關節(jié)炎的實驗研究.pdf

1、骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種慢性退行性關節(jié)疾病，多發(fā)于老年人群，以女性多見，嚴重影響患者的生活質量，消耗大量的個人及社會財力。目前，OA的治療包括傳統(tǒng)的藥物治療和外科手段，療效有限，無法阻止OA的進一步發(fā)展。近年來，應用組織工程技術，通過組織和/或細胞移植來獲得更多的接近于正常的透明軟骨，從而達到軟骨修復的目的。但是，由于組織和種子細胞的來源有限，限制了該項技術進一步發(fā)展，尤其對缺損較為嚴重軟骨組織?；蜣D染為組

2、織工程的發(fā)展開辟了新的途徑，將功能基因片段整合到基因載體內，再將基因載體轉染入靶細胞中或轉染入關節(jié)腔內，通過轉基因的靶細胞持續(xù)大量分泌功能基因產物，在一個較長的時期保持局部較高的治療濃度，從而達到治療目的。目前已有許多研究表明基因治療對OA的有效性，并且多基因聯(lián)合治療OA效果好于單基因。關節(jié)軟骨的結構和功能依賴于其合成代謝與分解代謝的相互作用和平衡，一方面，合成代謝中的生長因子以轉化生長因子-β(TGF-β)家族為主，另一方面，分解代謝

3、中的炎性因子以白細胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)為主。在臨床應用之前，我們有必要在細胞實驗和動物實驗中確證哪些功能基因或基因的組合會對OA產生更好的治療效果。本實驗，以逆轉錄病毒為載體將重組人IL-1Ra(分解代謝因子IL-1受體拮抗蛋白)和TGF-β1(合成代謝重要因子)基因轉染至正常的軟骨細胞及OA的軟骨細胞，觀察其對軟骨細胞增殖的影響；另外我們將基因直接注射到兔膝骨關節(jié)炎動物模型的關節(jié)內，從促進軟骨細胞及基

4、質合成和抑制軟骨細胞及基質分解兩個層面來研究治療OA的療效。
　　 第一部分聯(lián)合基因轉染兔膝正常軟骨細胞及OA軟骨細胞
　　 對其增殖代謝的影響
　　 目的：觀察以逆轉錄病毒為載體，介導白細胞介素-1受體拮抗蛋白(IL-1Ra)基因與轉化生長因子-β1(TGF-β1)基因共轉染兔膝關節(jié)正常及OA軟骨細胞后，觀察IL-1Ra及TGF-β1基因含量的表達，及對正常及OA軟骨細胞增殖代謝的影響。
　　 方法：將

5、體外培養(yǎng)的正常及OA軟骨細胞分別分為空白轉染組、空載體轉染組、IL-1Ra單基因轉染組、TGF-β1單基因轉染組及IL-1Ra和TGF-β1雙基因轉染組。用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)對其分別進行瞬時基因表達(基因轉染后48h)。
　　 結果：基因轉染48h后，正常軟骨細胞及OA軟骨細胞空白組與PLNCX2空載體轉染組的上述指標差異無顯著性(P＞0.05)；基因轉染組有明顯基因表達，與空白組及PLNCX2空載體轉染組相比(P

6、＜0.05)，雙基因轉染組較單基因轉染組IL-1Ra、TGF-β1含量均明顯提高(P＜0.01)。IL-1Ra單基因轉染時在正常軟骨細胞與OA軟骨細胞比較IL-1Ra含量差異無顯著性(P＞0.05)，與TGF-β1雙基因轉染時在正常軟骨細胞與OA軟骨細胞IL-1Ra含量比較差異有顯著性(P＜0.05)；TGF-β1單基因轉染和雙基因轉染時在正常軟骨細胞與OA軟骨細胞中TGF-β1含量比較差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 結論

7、：基因轉染正常軟骨細胞及OA軟骨細胞后可獲得穩(wěn)定表達，IL-1Ra+TGF-β1雙基因轉染的軟骨細胞生物學活性優(yōu)于兩者中的任一單基因轉染，為基因治療骨關節(jié)炎的研究提供實驗基礎。OA軟骨細胞較正常軟骨細胞生物學活性較弱，對IL-1Ra、TGF-β1單基因和雙基因轉染反應性能不如正常軟骨細胞強。
　　 第二部分關節(jié)腔內注射逆轉錄病毒載體介導的重組人IL-1Ra和TGF-β1基因治療兔膝骨關節(jié)炎的研究
　　 目的：觀察膝關節(jié)內

8、注射逆轉錄病毒介導的白細胞介素-1受體拮抗蛋白(IL-1Ra)與轉化生長因子-β1(TGF-β1)基因在關節(jié)中的表達及對OA的治療效果。
　　 方法：用前交叉韌帶切斷法(ACLT)制造新西蘭白兔膝OA模型，共30只，隨機分為5組，Ⅰ組為空白對照組(未行ACLT處理)，Ⅱ組為手術對照組，Ⅲ組為IL-1Ra轉染組，Ⅳ組為TGF-β1轉染組，Ⅴ組為IL-1Ra和TGF-β1雙基因轉染組。外源基因注射后4周和8周，用PBS灌洗兔膝關節(jié)，

9、獲取關節(jié)液ELISA分析轉基因表達，取關節(jié)標本進行Mankin's評分，阿爾辛藍-過碘酸雪夫試劑(AB-PAS)染色，TGF-β1、IL-1Ra及Ⅱ型膠原原位雜交和免疫組化檢測。
　　 結果：在基因注射后4周和8周，空白對照組的大體評分和Mankin's評分明顯低于手術對照組差異有顯著性(P＜0.01)，手術對照組的大體評分和Mankin's評分高于單基因轉染組和雙基因轉染組差異有顯著性(P＜0.05)，基因治療8周與4周比較，

10、各對應組評分普遍提高，但差異無顯著性意義(P＞0.05)。關節(jié)液ELISA分析顯示空白對照組和手術對照組比較各因子含量無明顯差別差異無顯著性(P＞0.05)，與單基因轉染組和雙基因轉染組比較TGF-β1、IL-1Ra含量明顯增高差異有顯著性(P＜0.05)；單基因轉染組與雙基因轉染組比較，4周時雙基因轉染組各因子含量明顯高于單基因轉染組差異有顯著性(P＜0.05)，而8周時雙基因轉染組各因子含量略高于單基因轉染組差異無顯著性(P＞0.0

11、5)，8周與4周比較各基因含量有所減少，差異有顯著性(P＜0.05)。各基因轉染組原位雜交和免疫組織化學染色較空白對照組和手術對照組深，灰度值比較差異有明顯差異(P＜0.01)，單基因轉染組與雙基因轉染組灰度值比較差異有明顯差異(P＜0.01)，基因治療8周后，各對應組染色陽性細胞較4周時減少，除空白對照組與手術對照組外，各組灰度值與4周時比較均有差異有顯著性差異(P＜0.05)，8周時基因表達有所減弱。
　　 結論：以逆轉錄病