PKCα對肝癌藥物敏感性作用的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、【目的】
  肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國常見惡性腫瘤。誘發(fā)肝癌的因素很多,其中病毒性肝炎、肝硬化是重要病因?;熓歉伟┲饕委熓侄危伟┘?xì)胞對抗癌藥物產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象是導(dǎo)致化療失敗的主要原因,是肝癌臨床治療中的一大難題。腫瘤的多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)由多種機(jī)制調(diào)控,研究認(rèn)為, MDR表型的出現(xiàn)與P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的過

2、表達(dá)相關(guān),P-gp發(fā)揮著藥物泵功能,將藥物泵出細(xì)胞膜外。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的同工酶,特別是PKCα,對腫瘤細(xì)胞MDR表型的出現(xiàn)或維持可能起著決定性作用。因此研究PKCα對肝癌細(xì)胞的抗癌藥物敏感性的影響,有助于我們了解肝癌耐藥的發(fā)生機(jī)制,為克服肝癌臨床治療中的MDR提供實(shí)驗依據(jù)。
  【方法】
  1.將體外合成的載有目的片段的DNA鏈整合進(jìn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
  2.將反轉(zhuǎn)錄病毒載體熱

3、轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中培養(yǎng),藥物篩選陽性克隆后,提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒。
  3.按一定比例將無內(nèi)毒素質(zhì)粒與病毒包裝細(xì)胞混合后,在電轉(zhuǎn)儀下,將反轉(zhuǎn)錄病毒載體電轉(zhuǎn)入病毒包裝細(xì)胞。
  4.藥物篩選2星期后,將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。
  5.用病毒上清液感染人HepG2細(xì)胞。
  6.藥物篩選后,挑選陽性克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),并將其與PMA處理的HepG2細(xì)胞及未受干預(yù)的HepG2細(xì)胞做藥物敏感性及生長速度比較。
  【結(jié)果】

4、r>  1.Western blot顯示:與對照組(未受干預(yù)的HepG2細(xì)胞)相比,感染siRNA片段者PKCα的表達(dá)顯著減少;而感染空載體者無顯著變化;PMA可以刺激細(xì)胞內(nèi)PKCα的表達(dá)。
  2.siRNA和PMA對HepG2細(xì)胞生長速度的影響實(shí)驗表明,與對照組相比,轉(zhuǎn)染siRNA的HepG2細(xì)胞生長速度明顯減慢;PMA處理組速度略快;空載體組無顯著變化。
  3.藥物殺傷結(jié)果:經(jīng)過6次反復(fù)MTT后,計算各組對表阿霉素的

5、IC50值。對照組為10.2200±0.7805;轉(zhuǎn)染siRNA組6.4450±0.8549;轉(zhuǎn)染空載體組10.1500±0.9343,PMA處理組11.5400±1.3647。LSD-t檢驗結(jié)果顯示,與對照組相比,siRNA處理組、PMA處理組對表阿霉素的藥物敏感性變化均有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異(P<0.05),而空載體組與HepG2組比較無統(tǒng)計學(xué)意義上的差異。
  【結(jié)論】
  1.實(shí)驗中所采用的siRNA片段對細(xì)胞內(nèi)PKC

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