PKCα對肝癌藥物敏感性作用的研究.pdf

1、【目的】
　　肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國常見惡性腫瘤。誘發(fā)肝癌的因素很多，其中病毒性肝炎、肝硬化是重要病因?；熓歉伟┲饕委熓侄危伟┘?xì)胞對抗癌藥物產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象是導(dǎo)致化療失敗的主要原因，是肝癌臨床治療中的一大難題。腫瘤的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)由多種機(jī)制調(diào)控，研究認(rèn)為, MDR表型的出現(xiàn)與P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp)的過

2、表達(dá)相關(guān)，P-gp發(fā)揮著藥物泵功能，將藥物泵出細(xì)胞膜外。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的同工酶，特別是PKCα，對腫瘤細(xì)胞MDR表型的出現(xiàn)或維持可能起著決定性作用。因此研究PKCα對肝癌細(xì)胞的抗癌藥物敏感性的影響，有助于我們了解肝癌耐藥的發(fā)生機(jī)制，為克服肝癌臨床治療中的MDR提供實(shí)驗依據(jù)。
　　【方法】
　　1.將體外合成的載有目的片段的DNA鏈整合進(jìn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
　　2.將反轉(zhuǎn)錄病毒載體熱

3、轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中培養(yǎng)，藥物篩選陽性克隆后，提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒。
　　3.按一定比例將無內(nèi)毒素質(zhì)粒與病毒包裝細(xì)胞混合后，在電轉(zhuǎn)儀下，將反轉(zhuǎn)錄病毒載體電轉(zhuǎn)入病毒包裝細(xì)胞。
　　4.藥物篩選2星期后，將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　5.用病毒上清液感染人HepG2細(xì)胞。
　　6.藥物篩選后，挑選陽性克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并將其與PMA處理的HepG2細(xì)胞及未受干預(yù)的HepG2細(xì)胞做藥物敏感性及生長速度比較。
　　【結(jié)果】

4、r>　　1．Western blot顯示：與對照組（未受干預(yù)的HepG2細(xì)胞）相比，感染siRNA片段者PKCα的表達(dá)顯著減少；而感染空載體者無顯著變化；PMA可以刺激細(xì)胞內(nèi)PKCα的表達(dá)。
　　2．siRNA和PMA對HepG2細(xì)胞生長速度的影響實(shí)驗表明，與對照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA的HepG2細(xì)胞生長速度明顯減慢；PMA處理組速度略快；空載體組無顯著變化。
　　3．藥物殺傷結(jié)果：經(jīng)過6次反復(fù)MTT后，計算各組對表阿霉素的

5、IC50值。對照組為10.2200±0.7805；轉(zhuǎn)染siRNA組6.4450±0.8549；轉(zhuǎn)染空載體組10.1500±0.9343，PMA處理組11.5400±1.3647。LSD-t檢驗結(jié)果顯示，與對照組相比，siRNA處理組、PMA處理組對表阿霉素的藥物敏感性變化均有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異(P<0.05)，而空載體組與HepG2組比較無統(tǒng)計學(xué)意義上的差異。
　　【結(jié)論】
　　1．實(shí)驗中所采用的siRNA片段對細(xì)胞內(nèi)PKC