鹽酸川芎嗪通過mTOR信號通路和凋亡通路抑制前列腺癌PC-3細胞的增殖.pdf

1、前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，在腫瘤中死亡率居于第六位，全世界每年大約有903，500個新增病例，其中258，400人死亡。近年來，隨著診斷技術的提高，篩選程序的有效開展，在包括中國等亞歐國家中，前列腺癌發(fā)病率均呈上升趨勢。抗雄激素療法在治療初期確實起到了一定的效果，但隨著治療的進行，患者在幾年內不可避免地對激素治療發(fā)生抵抗，即去勢抵抗性前列腺癌。對于這種對內分泌治療不敏感的激素非依賴性前列腺癌，始終沒有較理想的治療方法，已日益成

2、為臨床亟待解決的難題。
　　PI3K/Akt/mTOR信號通路是前列腺癌的一個重要治療靶點，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR是一種進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，從屬于PI3K家族成員，是PI3K/Akt信號通路的下游效應器。mTOR廣泛表達于細胞中，調控著不同細胞包括存活、增殖在內的多項細胞功能。其中，mTORC1一方面接受細胞外信號調節(jié)著包含5'末端(TOP)mRNAs的翻譯，另一方面充當調控帽依賴RNA翻譯起始的級聯(lián)信號通

3、路的中樞。4E-BP1是mTOR下游的關鍵信號蛋白，也是蛋白質合成中的負向調控因子，它可抑制eIF-4G與eIF-4E的結合，最終抑制蛋白質翻譯的起始過程。當4E-BP1被mTOR磷酸化后，從eIF-4E解離下來，eIF-4E去抑制，eIF-4E從而與eIF-4A、eIF-4G結合，形成eIF-4F復合物，并與mRNA帽結合，啟動帽依賴性的蛋白質翻譯起始。同時，mTORC1還可以磷酸化p70核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)，從而磷酸化

4、S6蛋白的小核糖體亞基，與其他激酶一起促進蛋白翻譯。在前列腺癌和其它多種實體瘤中，mTOR是與腫瘤生成和治療抵抗均相關的關鍵蛋白。且在前列腺癌中，mTOR信號通路整合細胞存活相關信號，mTOR及其下游關鍵蛋白多處于活化狀態(tài)。
　　和細胞增殖一樣，細胞凋亡也是一個受多條信號通路多個基因調控的復雜過程，在受到有害或異常刺激時，細胞通過凋亡進行自我破壞以維持自體穩(wěn)態(tài)，是一種保護性的生物學反應。凋亡通路的失調可能通過促進異常細胞的過度增殖

5、，最終導致癌癥的發(fā)生，所以凋亡信號通路是腫瘤治療的一個關鍵靶點。
　　川芎是一種中藥植物，藁本屬，傘形科，因其良好的促血液循環(huán)作用而頗受關注。川芎最主要的有效成分是川芎嗪(TMP,2，3，5，6-Tetramethylpyrazine)，川芎嗪通過抗血小板聚集和調節(jié)微動脈小動脈可以改善微循環(huán)，并且川芎還具有抗氧化，抗纖維化，以及鈣拈抗等作用。鹽酸川芎嗪已經(jīng)作為一種預防和治療血管疾病的藥物在臨床廣泛使用多年，且近年來研究顯示川芎嗪還

6、有抑制腫瘤生長、多藥耐藥、遷移等多重抗腫瘤效應。
　　本研究中，我們首先用MTT比色法觀察鹽酸川芎嗪對前列腺癌PC-3細胞增殖的影響，然后對鹽酸川芎嗪抑制前列腺癌PC-3細胞增殖作用的機理進行了探討:(1)通過Western Blot檢測mTOR信號通路關鍵蛋白mTOR、p70S6K、S6、eIF4E和4E-BP1的磷酸化表達，且通過7-甲基-GTP Pull down繼續(xù)探討鹽酸川芎嗪對前列腺癌PC-3細胞翻譯起始蛋白表達的影響

7、，最后通過LUC熒光素酶證實PC-3細胞蛋白合成率變化;(2)采用流式細胞術和Hochest33342染核觀察細胞凋亡情況，以及western blot觀察凋亡相關蛋白的表達。這些研究將為鹽酸川芎嗪治療腫瘤提供理論基礎和支持。
　　方法：
　　1.0、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2、8.4mM的鹽酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3細胞48h和72h，刺激人結腸直腸癌細胞HCT-116和前列腺上皮細胞RWPE

8、-148h，MTT檢測鹽酸川芎嗪對其增殖能力的影響。
　　2.0、4.8、7.2mM的鹽酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3細胞48h:
　　(1)檢測對mTOR信號通路的影響Western Blot檢測 mTOR、p70S6K、S6、eIF4E和4E-BP1蛋白及蛋白磷酸化的表達(磷酸化刺激時間45min)。
　　7-甲基-GTP pulldown檢測4EBP1和eIF4E蛋白表達(刺激時間為24h)。
　　LUC熒光

9、素酶檢測細胞蛋白合成率變化。
　　RT-PCR檢測熒光素酶基因的變化。
　　(2)檢測對凋亡的影響流式細胞儀檢測細胞凋亡情況.
　　Hochest33342染核后熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)學改變。
　　Western Blot檢測凋亡相關蛋白的表達。
　　3.數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學統(tǒng)計軟件(SPSS17.0)處理，組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD檢驗。
　　結果：
　　1.0、

10、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2、8.4mM的鹽酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3細胞、人結腸直腸癌HCT-116細胞，和前列腺上皮RWPE-1細胞后，PC-3和HCT-116兩種腫瘤細胞增殖明顯受抑制(p＜0.05)，且PC-3細胞呈濃度和時間依賴性(p＜0.05)，而RWPE-1增殖無明顯影響(p＞0.05，MTT檢測)。
　　2.4.8mM和7.2mM的鹽酸川芎嗪
　　(1)對mTOR信號通路的影響明顯

11、抑制mTOR及其下游關鍵蛋白(p70S6K、S6、eIF4E、4E-BP1)的磷酸化(p＜0.01)，而這些蛋白本身的表達水平無明顯變化(p＞0.05，western blot檢測)。
　　明顯上調4E-BP1與eIF4E的結合，下調eIF4E的表達(p＜0.05，7-甲基-GTP Pulldown檢測)。
　　明顯抑制Luciferase報告基因的表達(p＜0.05，LUC熒光素酶檢測)，但其Luciferase mRNA

12、水平無明顯變化(p＞0.05，RT-PCR檢測)。
　　(2)對凋亡的影響促進前列腺癌PC-3細胞的凋亡(p＜0.05，流式細胞術)誘發(fā)前列腺癌PC-3細胞核的形態(tài)改變（Hochest33342染核，熒光顯微鏡觀察）。
　　上調凋亡相關蛋白Bax和Caspase-3表達(p＜0.05)，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(p＜0.05，western blot檢測)。
　　結論：
　　鹽酸川芎嗪對前列腺癌PC-3細胞