人腦膠質瘤細胞U251光動力瘤苗的制備及其體外細胞毒性的實驗研究.pdf

1、腦膠質瘤是最常見的中樞神經系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，其發(fā)病率占全部顱內腫瘤的40％-50％，惡性度高，且呈浸潤性生長，手術難以全切除，容易復發(fā)；又因中樞神經特有的血腦屏障結構以及腦組織對放射線的耐受性差等特點，所以傳統(tǒng)的手術加放療加化療的治療模式往往效果不好，治愈率極低而且并發(fā)癥較多，術后往往遺留神經功能缺失，如偏癱、失語，甚至出現思維、情感障礙，尤其是復發(fā)率極高。據報道傳統(tǒng)的治療模式，惡性膠質瘤病人的中位生存期不到一年[1]。因此，探索新的治療

2、方法和治療模式顯得格外重要，而各種腦膠質瘤疫苗尤其是樹突狀細胞(Dendritic cells DCs)疫苗的出現，使人們看到了曙光。 關于膠質瘤的各種新型的治療模式層出不窮，近年來關于膠質瘤的綜合免疫治療模式報道較多，尤其是關于膠質瘤的DC疫苗方面，有的已經報道用于臨床，效果較好；但膠質瘤的DC疫苗仍然存在許多不足：比如沒有特異性好的腫瘤抗原，存在自身免疫性疾病的可能等。 腫瘤的光動力治療(Photodynamic t

3、reatment PDT)以前認為是一種利用腫瘤組織與光敏劑高度親和性的特點，通過一定波長光激發(fā)滯于腫瘤組織的光敏劑，從而產生單態(tài)氧，破壞腫瘤細胞或者腫瘤血管，從而達到治療腫瘤的一種新方法[2]?，F在認為PDT治療腫瘤時不僅僅只是利用單態(tài)氧發(fā)揮作用，還可以使細胞表面產生一些免疫改變：比如分泌IL-12、TNF-a等細胞因子，同時PDT作用誘發(fā)的氧化應激反應也可促進應急蛋白：如HSP70等的表達，然后通過激活核因子kB和AP-1，間接控制

4、多種細胞因子如：IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)、粒集落刺激因子(CSF)、Toll樣受體等及其免疫相關基因的表達，從而誘發(fā)較強的免疫應答反應[3-6]。本實驗利用自體“血清+雞尾酒法”從正常成人外周血中分離、誘導成熟的DCs作為抗原呈遞細胞，將光動力處理過的人腦膠質瘤細胞U251所發(fā)生的細胞表面免疫表達以及免疫改變信息獲取，從而制備成膠質瘤的光動力疫苗，并通過體外細胞毒實驗和普通的凍融疫苗以及熱休克疫苗的殺傷效應作比較。

5、 研究目的： 1.制備膠質瘤兩種光動力疫苗； 2.在體外證明光動力疫苗的細胞毒效應。 材料與方法： 1.人腦膠質瘤細胞U251對光敏劑HMME(血卟啉單甲醚)的吸收以及排泄特性的研究： 取對數生長的U251與不同濃度的光敏劑HMME分別孵育不同的時間，然后用流式細胞儀檢測孵育后細胞的平均熒光強度，間接推測細胞內的光敏劑濃度，了解人腦膠質瘤細胞U251對光敏劑HMME的吸收以及排泄的特性，從而

6、確定U251細胞孵育的光敏劑濃度以及孵育時間，以達到下游實驗需要的細胞內光敏劑最佳濃度，并且希望確定細胞內的光敏劑開始排泄的時間，指導臨床治療病人的避光時間。 2.HMME-PDT時不同功率密度對U251的光動力效應的影響： 取已和光敏劑孵育達到最佳細胞內光敏劑濃度的U251細胞用He-Ne連續(xù)性激光逐孔照射，調定各組能量密度不同，照射后用MTT法檢測各組各孔細胞死亡率，同時設定無激光照射和無光敏劑的空白對照組和單用激光

7、照射和單用光敏劑的陰性對照組，從而確定不同功率密度對光動力效應的影響。 3.人腦膠質瘤細胞U251的培養(yǎng)以及各種抗原的提取和制備： 取足夠數目(107以上)對數生長期的U251細胞，分成四組用四種不同的方法制備各種抗原；①組：凍融抗原：凍融法提取全細胞抗原；②組：熱休克抗原：利用“熱休克法”提取熱休克抗原；③組：光動力全細胞抗原：利用上游實驗確定好的能量密度的激光照射已和光敏劑孵育過的達到細胞內光敏劑濃度最佳的U251細

8、胞，再用高速離心法提取光動力處理后死細胞的全細胞抗原：④組：光動力細胞表面抗原：用弱酸洗脫法提取光動力處理后活細胞表面的洗脫抗原。 4.“自體血清+雞尾酒法”分離誘導外周血DCs成熟的研究： 取正常成人外周血約180ml，分成三組分離DCs并誘導其成熟：①：經典脂多糖(Lipopolysaccharid LPS)誘導組：從外周血分離單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells PBMC

9、s)，用RPMI1640+FBS(胎牛血清)的完全培養(yǎng)基接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，兩小時后棄懸浮細胞，將貼壁單個核細胞，用GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor)和IL-4(Imerleukin-four)，培養(yǎng)，培養(yǎng)到第6天時加入LPS誘導24小時收集；②：“雞尾酒”誘導組：單個核細胞的分離及培養(yǎng)同①組，培養(yǎng)到第6天時用細胞因子組合(1000U／ml TNF-α、

10、10ng／ml IL-6、10ng／mlIL-β、1ug／ml PGE2)誘導24小時收集；③：自體血清+“雞尾酒”誘導組：從外周血分離PBMC后，用RPMI1640+10％自體血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導方法同②組。將以上三組分離、誘導的外周血DCs在純度、成熟度、形態(tài)上以及刺激淋巴細胞增殖能力上做比較。 5.DCs的“自體血清+雞尾酒法”分離培養(yǎng)、誘導成熟以及四種瘤苗的制備： 首先用“自體血清+雞尾酒法”從外周血分離出

11、足量未成熟DCs，第6天分組誘導成熟，①：凍融抗原負載誘導組：凍融法制備的腫瘤細胞抗原負載聯合雞尾酒法誘導成熟DCs；②：熱休克抗原負載誘導組：熱休克法制各的腫瘤細胞抗原負載聯合雞尾酒法誘導成熟DCs；③：光動力全細胞抗原負載誘導組：光動力法制備的全細胞抗原負載聯合雞尾酒法誘導成熟DCs；④：光動力洗脫抗原負載誘導組：光動力法制備的沈脫抗原負載聯合雞尾酒法誘導成熟DCs。各組均在誘導24小時后收獲DCs用于下游細胞毒實驗。 6.

12、淋巴細胞的分離、培養(yǎng)和篩選以及各種瘤苗誘導特異性CTL細胞毒實驗： 參照文獻報道用尼龍毛柱分選法分選外周血分離的非貼壁的單核細胞(主要是淋巴細胞)，分選后的淋巴細胞于24孔板用添加了100U／ml IL-2的RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，用于下游實驗；將上游實驗各組制備的成熟的經過抗原負載的DCs 2×105／ml與分選過的淋巴細胞(主要為T淋巴細胞)共培養(yǎng)5天，成為免疫效應細胞；然后再和靶細胞U251共培養(yǎng)24小時，用MT

13、T法檢測靶細胞的存活率，從而比較各組瘤苗的體外細胞毒效應。實驗 結果： 1.人腦膠質瘤細胞U251對光敏劑HMME(血卟啉單甲醚)的吸收、代謝以及排出特性：流式細胞儀測定結果表明：當光敏劑濃度恒定為40ug／ml時，隨著孵育時間的增加，細胞內光敏劑濃度總體趨勢是增加的，但到了36小時后總體趨勢是下降的，說明細胞內光敏劑已經開始排泄，并且2小時內增加趨勢明顯，2小時后增加趨勢明顯變緩，各組差別無統(tǒng)計學意義；當孵育時間恒定為

14、2小時，隨著的光敏劑濃度增加，細胞內光敏劑濃度總體趨勢是增加的，并且在增加到40ug／ml前趨勢明顯，之后明顯變緩。 2.HMME-PDT時不同功率密度對U251的光動力效應的影響： 在光敏劑濃度和孵育時間恒定的情況下，隨著功率密度的增加，U251細胞的存活率明顯下降；當功率密度達到2.4J／cm2時，死亡率幾乎為50％，當功率密度達到7.2J／cm2時，死亡率幾乎為100％；單用激光對U251的死亡率沒有影響，單用光敏

15、劑，在光敏劑濃度不超過40ug／ml時，對U251細胞沒有毒性作用。 3.“自體血清+雞尾酒法”誘導外周血DCs的成熟度、純度以及刺激淋巴細胞增殖能力分析：“自體血清+雞尾酒法”誘導的DC成熟過程中形態(tài)好、突起多；成熟表型CD80、CD86、CD83以及HLA-DR的平均表達率分別是88.60％、50.55％、73.89％、93.24％，明顯高于其它兩組，提示自體血清+“雞尾酒法”誘導組的DC細胞純度及成熟度均最高；激活淋巴細胞

16、增殖指數為2.03，明顯高于其它兩組。 4.四組瘤苗的體外對靶細胞的細胞毒效應比較結果： 通過MTT檢測結果表明：四組瘤苗的體外對靶細胞的細胞毒效應大小分別是洗脫組>全細胞抗原組>熱休克抗原組>凍融抗原組。 結論： 1.人腦膠質瘤細胞U251對光敏劑HMME的吸收量是與孵育時間(≦2h)和光敏劑濃度(≦40ug／ml)成正相關。 2.在一定條件下，PDT效應與能量密度成正相關；單用激光對細胞無殺傷