基于表面分子開關的生物傳感器新方法研究.pdf

1、科學和技術發(fā)展最重要的挑戰(zhàn)之一就是進一步實現對微觀的控制和研究，這就意味著要利用化學手段自下而上(bottom-up)來構建分子水平上器件和機器，即從原子或分子開始建造微觀結構。“自下而上”是指以原子，分子為基本單元，根據人們的意愿進行設計和組裝，從而構筑成具有特定功能的器件。同時，隨著微電子技術和生物工程這兩項高科技的互相滲透，分子開關實際上已為研制分子器件提供了可能。所謂分子開關泛指結構上組織化了的具有“開/關”功能的化學體系。它也

2、是指具有雙穩(wěn)態(tài)的量子化體系，當外界光、電、熱、磁、酸堿度等條件變化時，分子的形狀、化學鍵的生成或斷裂、振動以及旋轉等性質會隨之變化，通過這些幾何和化學的變化，能實現信息傳輸的功能。 分子水平上的開關需要一個外部刺激來引起電子和原子核的重排，3種用來開啟化學體系功能的最重要的刺激是光能(光子)，電能(電子或空穴)和化學能(以質子、金屬離子或特殊分子形式)。最常見的光化學激發(fā)開關過程與光異構化和光誘導氧化還原反應是相關的。如果輸入的

3、是電化學激發(fā)，當然就是氧化還原反應的誘導反應，與化學激發(fā)相比，光化學和電化學激發(fā)的分子開關更容易發(fā)生且響應迅速。利用電化學能代替化學氧化還原作用，具有開、關簡便快捷的優(yōu)勢。況且，電化學技術也是監(jiān)測機器運行的有用方式，電極則是分子系統(tǒng)與宏觀世界相連的最佳方式。電場控制的表面分子開關可以用于蛋白質的可控吸附和分離．再結合分子設計、有機合成和高分子化學，還可以給這種表面引入親疏水功能團或抗原抗體識別對等，方便的實現親疏水開關或者免疫開關表面。

4、 本論文主要創(chuàng)新之處是基于自組裝膜技術、電化學控制技術以及溫敏聚合物材料構建具有表面分子開關功能的仿生界面，從而利用這些智能化表面對生物分子及其動態(tài)相互作用過程進行實時在線控制和檢測。智能化表面(smart surface)通常是指具有可操控開關功能的生物應用表面。智能化表面性質的可逆操控，是在外界激勵下發(fā)生的。它可以由聚合物、有序自組裝膜、納米材料(特別是金屬氧化物)等組成，激勵它發(fā)生性質可逆轉化的因素包括溫度、光照、電場、p

5、H值、溶劑等等。在這些外界激勵下，表面分子可以發(fā)生可逆的構象轉化、構型轉化、氧化態(tài)的轉化等等，從而在宏觀上，使整個表面呈現出親疏水性、光學性質、帶電性等性質的可逆轉化，即可呈現出“開/關”的性質。本論文通過構建的低密度自組裝膜，在表面上形成電化學可操控的具有生物識別能力的親疏水開關，從而實現了對抗生物素一鏈霉親和素功能蛋白間微觀作用過程的快速、靈敏、可控檢測和表征。進一步地，利用溫敏高分子材料poly(N-isopropylacryla

6、mide)PNIPAAm與抗BSA抗體合成生物復合物，構建了具有溫度敏感開關功能的可再生免疫傳感器。該方法可保持生物識別體系的活性和環(huán)境，再生的抗原／抗體表面均可重復識別相應目標物，檢測靈敏度高、速度快，所構建的溫敏開關免疫傳感器可重復使用30次以上，解決了目前免疫傳感器抗體表面僅能單次使用的弊端，同時為研究蛋白質一蛋白質動態(tài)相互作用過程提供了新手段。本論文共五章內容，主要摘要如下： 第一章綜述了表面分子開關的研究現狀及其相關技

7、術在生物傳感器領域的應用進展。分子自組裝和高分子聚合物是構建分子開關的兩條重要途徑。自組裝單分子層是構膜分子與基底材料間發(fā)生物化作用而自發(fā)形成的一種熱力學穩(wěn)定、排列規(guī)則的單層分子膜。這種構膜方式，可以容易的為表面引入各種各樣的功能團，這就為制備具有多種不同功能的智能化表面打下了很好的基礎。溫敏材料是指對溫度可感知且可響應并具有功能發(fā)現能力的一類材料。具有“溫度開關”特性的聚-N異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)是近年來引起研究興趣的一類高

8、分子材料。利用它對溫度響應的敏感性，使其在藥物緩釋、免疫分析、生命科學等研究領域都有著廣泛的潛力。 第二章介紹了基于人工自組裝膜技術構建表面親疏水開關發(fā)展生物傳感器的新方法。本章利用環(huán)糊精作為巰酸分子間距有效的調控手段，以乙醇作為高效的洗脫溶劑，通過自組裝方法在金電極表面構建了間距均一、性能穩(wěn)定的巰基化合物低密度薄膜，由此構建了具有親疏水可逆開關的智能化表面生物傳感器。以高密度自組裝膜表面的覆蓋度為100％計算可知，α，β，γ三

9、種環(huán)糊精分子構建的低密度自組裝膜表面的覆蓋度分別為61.2％， 45.3％和29.2％。通過改變外加電壓狀況，使巰基化合物構型發(fā)生改變，從而實現表面的親水／疏水性能的轉換。通過質譜，核磁，交流阻抗，QCM，熒光等多種檢測手段對膜表面可逆過程進行了實時監(jiān)控。 第三章主要圍繞此類親疏水開關生物傳感器進行抗生物素及鏈霉親和素可控組裝的應用研究。本章采用熒光標記抗生物素、鏈霉親和素功能蛋白分子作為研究對象，通過改變外加電流正負情況使得低

10、密度自組裝膜表面具有親疏水可逆轉換性能。在pH值為7.4的緩沖溶液中，兩種蛋白質由于等電點的差異而帶上了兩種不同的電荷，由于表面電荷作用及親疏水性質的轉換，兩種蛋白質可以在外加電場作用下發(fā)生可控組裝行為。主要利用EQCM實驗和熒光光譜實驗對兩種蛋白質的可控組裝進行了實時監(jiān)測，對于Avidin蛋白在β-CD構建的低密度自組裝膜上的組裝過程，將其在負電壓下組裝30分鐘后它的熒光強度是正電壓條件下的4.9倍。對于Streptavidin蛋白來

11、說，當外加正電壓30分鐘后，在β-CD構建的低密度自組裝膜表面上蛋白組裝量分別是負電壓條件下同種組裝膜的1.5倍。利用微電極中獲得的良好分離分析效果，我們還初步嘗試將之應用于微流控芯片體系，發(fā)展了一種利用“分子開關”原理構建的蛋白質芯片。 第四章是基于溫敏聚合物的表面分子開關構建及抗原抗體可逆識別界面的研究。本章主要研究溫敏高分子材料PNIPAAm與抗BSA抗體合成的生物復合物(bioconiugate)組裝到金表面與對應抗原B

12、SA識別時的可逆過程。由于這種溫敏高分子材料的存在，這個結合過程與抗體．抗原直接結合的情況有很大變化，選擇不同分子量的聚合物進行構建，該材料對抗原結合過程中造成的空間位阻有所不同，結合量可通過測定QCM，交流阻抗法，天然PAGE膠以及熒光標記抗原的光亮度加以定量。當抗原抗體結合完畢后，改變溶液的溫度，由于溫敏材料分子量的差異，高分子量時隨著溫度升高，抗體結合位點附近的高分子材料會團聚在已經結合的抗原周圍，而且會產生較大的空間力以及疏水力

13、，從而將已經結合的抗原從抗體結合部位頂開，使得所構建的溫敏開關免疫傳感器具有良好的再生功能。高溫降至低溫過程中，免疫識別體系抗原抗體結合常數差別可以達到兩個數量級。高分子量聚合物構建的免疫開關傳感器對于抗原抗體結合后表面的再生率最高可以達到89％以上，跟通常文獻中大量報道的有機溶液再生表面法(再生率80％-92％)相差很小，而且這個方法基本沒有破壞生物識別體系的活性和環(huán)境，抗原抗體均可重復利用，這種溫敏開關免疫傳感器可重復使用30次以上

14、，抗疲勞性較好。綜上所述，這種基于溫敏聚合物的表面開關可以在免疫生物傳感領域進行廣泛的應用。 第五章工作圍繞基于手性氨基酸抗體構建電容型手性免疫傳感器進行相關研究。利用自制手性抗體構建高選擇性的新型電容型免疫傳感器，設計了逆向競爭法進行檢測，得到了很好的響應，這一部分工作仍在進行中。構建的電容性手性免疫傳感器從所有的圖表中可以看出這種傳感器對于小分子的手性氨基酸具有很強的識別和分析能力，檢測限可以達到5 pg/mL，對氨基酸混合

15、物中痕量D型苯丙氨酸可以達到0.001％的檢測靈敏度。競爭法測定靈敏快速，既可以測定D型、L型苯丙氨酸對電極表面半抗原與抗體免疫識別的抑制情況，還可以測定消旋體中單一構型(D型)氨基酸含量，此方法對于混合氨基酸體系中痕量的單一構型抗原檢測限比標準的手性色譜分析方法還要低一個數量級，具有高靈敏度、高選擇性的特點，為無標記法檢測手性氨基酸提供了一種可行的檢測方法。具有操作簡便，重現性好，成本低廉等一系列優(yōu)點，對于手性物質的快速在線分析對于臨