雙重靶效應基因嵌合重組體的構建與表達.pdf

1、研究發(fā)現(xiàn)基質細胞衍生因子（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1）及其受體CXCR4（CXC chemokine receptor-4）是決定乳腺癌轉移的關鍵因子。我們對SDF-1進行多位點定向遺傳改造，從中篩選出能與CXCR4高特異性結合，但不能激活CXCR4耦聯(lián)的G蛋白下游信號通路的拮抗劑。此拮抗劑通過競爭性地阻礙野生型SDF-1與CXCR4的結合，破壞乳腺癌原發(fā)灶與遠程特定轉移器官之間所存在的SDF

2、-1梯度，切斷乳腺癌轉移的潛在通路，從而抑制乳腺癌的轉移。近年來，小分子富含亮氨酸蛋白糖甙家族成員---飾膠蛋白（Decorin）因被證實是一強的腫瘤細胞生長負性調節(jié)因子而成為腫瘤研究領域的熱點。研究表明Decorin通過特異性阻斷表皮生長因子受體-2(HER-2)高表達而抑制癌細胞浸潤性生長。本研究的主要目的是將SDF-1的突變體通過人類IgG1抗體重鏈的鉸鏈區(qū)(IgG1 Heavy Chain Hinge Region,以下簡稱Hi

3、nge)與Decorin連接而構建雙重靶效應基因嵌合重組體，以抑制乳腺癌的生長和轉移。 一共構建了三種嵌合基因SDF-1p2g-Hinge-Decorin（以下簡稱p2gch），SDF-1p2g54-Hinge-Decorin（以下簡稱p2g54ch）和SDF-wt-Gly×4-Decorin（以下簡稱wtch）。P2gch的構建方法為：以本室構建的野生型hSDF-1基因為摸板，采用PCR定點突變的方法，將SDF-1的N端第二個

4、氨基酸Pro突變?yōu)镚ly，所形成的突變體SDF-1p2g再通過人工合成的Hinge與采用RT-PCR法從人骨髓中克隆的Decorin成熟肽編碼序列相連，即得到嵌合基因p2gch。P2g54ch是在構建p2gch的基礎上采用PCR的方法進一步使SDF-1 C端α-螺旋缺失而形成的嵌合基因p2g54ch。由于后來發(fā)現(xiàn)這兩種嵌合基因所表達的蛋白P2Gch和P2G54ch不夠穩(wěn)定，有分解現(xiàn)象，遂決定將SDF-1與Decorin之間的連接片斷Hi

5、nge替換為結構更簡單的四個甘氨酸（Gly-Gly-Gly-Gly）短肽，因而構建了第三種嵌合體wtch，其構建方法為：通過引物設計將 Gly×4直接連在野生型SDF-1基因（SDF-wt）的3-端，然后Gly×4再與PCR得到的Decorin連接即得到嵌合基因wtch。將構建好的嵌合基因插入原核表達載體pET-30a(+)，轉入大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導表達。由于突變型嵌合蛋白P2Gch和P2G54ch在N端帶有載體表

6、達的6×His標簽，野生型嵌合蛋白WTch在C端帶有載體表達的6×His標簽，因此三種嵌合蛋白均可在變性條件下用鎳柱親和層析進行純化。純化產物用稀釋、透析和超濾法進行復性，復性的蛋白用MTT法初步檢測其活性。 基因測序結果表明三種嵌合體構建完全正確，SDS-PAGE檢測結果表明三種嵌合體均能在大腸桿菌BL21(DE3)中大量表達，表達產物主要以包涵體形式存在，Western-blot證實表達產物是目標蛋白。表達產物在變性條件下用