低劑量的ECPs誘導機體適應性反應差異表達基因的研究.pdf

1、機體及其細胞經(jīng)常受到各種環(huán)境因子的作用。環(huán)境中存在著物理、化學和生物等不同因子，它們引起機體和細胞的反應特點，一方面受制于機體固有遺傳結構的進化發(fā)育階段和功能狀態(tài)，另一方面取決于環(huán)境因子的性質和劑量。隨著工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境化學因子日益增多，其對健康的影響受到關注。近年來，高濃度接觸所致急性中毒和損傷在人們的努力下已大為減少，而代之低濃度，甚至是極低濃度的接觸，這些接觸和高濃度接觸在健康效應上有著什么樣的區(qū)別；在進行危險度評定和管理中應采取

2、什么樣的策略；在保護環(huán)境和人體健康的前提下，如何更好地促進化學工業(yè)的發(fā)展；是人們更為關心的問題。所以，低水平的環(huán)境化學因子誘導機體產(chǎn)生的生物學效應和機制及其對人類健康評定的影響成為目前毒理學領域研究的熱點。本研究建立了ECPs包括過氧化氫(H2O2)、甲醛(FA)、三氯乙烯(TCE)、氫醌(HQ)誘導細胞適應性反應的模型，并用熒光差異顯示PCR技術尋找不同處理差異表達的基因，通過進一步的鑒定和驗證，為探討低劑量的ECPs誘導細胞適應性反

3、應的機制提供科學依據(jù)。 方法：1ECPs誘導細胞適應性反應模型的建立 用一系列劑量的H2O2對人胚肺成纖維細胞(MRC-5)進行染毒，MTT法獲得H2O2對細胞毒性的劑量效應關系和時間效應關系。選擇對細胞沒有損傷或者有增殖效應的劑量為低劑量，對細胞有明顯損傷效應的劑量為高劑量，然后用低劑量的毒物預刺激細胞一定的時間后，繼而用大劑量的同一毒物攻擊，觀察細胞的損傷效應，將低劑量預刺激后可以減輕繼而大劑量攻擊的損傷效應的一組劑

4、量作為適應型反應模型的劑量。用乳酸脫氫酶漏出率(LDH％)、Annexinv/PI檢測細胞凋亡來驗證H2O2誘導MRC-5適應性反應的模型。FA、TCE、HQ的劑量效應關系及其適應性反應模型的建立由課題組的其他科研人員進行。 2熒光差異顯示PCR尋找不同處理組差異表達的基因 H2O2、FA、TCE、HQ分別對細胞進行染毒，按：對照組、低劑量組、高劑量組，適應性反應組處理細胞，在各組細胞染毒終止后，提取細胞總RNA，用無R

5、NA酶的DNA酶清除污染的DNA，紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳分別檢測其純度和完整性。優(yōu)化熒光差異顯示PCR的錨定引物(APs)和隨機引物(ARPs)，然后用APs進行逆轉錄(RT)反應，合成cDNA，再用優(yōu)化的APs和ARPs組合，進行熒光差異顯示PCR，最后進行5.6％聚丙烯酰胺凝膠電泳。通過GenomyxSC掃描系統(tǒng)掃描，用系統(tǒng)所帶的AcquireSC軟件進行定位，分離差異表達的基因。 3差異條帶的再擴增、克隆、鑒定、測

6、序及同源性比較 選擇感興趣的差異條帶進行再擴增，電泳鑒定后，克隆到pGEM-T載體，對陽性重組菌通過菌落PCR鑒定，測序。然后將獲得的序列和NCBI上提供的包括GeneBank+EMBL+DDBJ+PBD的核酸序列數(shù)據(jù)庫BLAST，進行同源性分析。4用熒光定量PCR方法驗證目的基因是否差異表達 將H2O2處理的各組細胞的總RNA進行常規(guī)RT，然后以cDNA為模板，根據(jù)條帶的測序結果按熒光定量PCR要求設計引物，采用SYB

7、RGreenⅠ熒光染料相對定量的方法檢測基因的表達。以β-actin為內(nèi)參，通過目的基因和內(nèi)參的標準曲線來保證兩者的擴增效率相同，以便相對定量。熔解曲線消除引物二聚體對結果的影響。然后進行相對定量驗證所得目的基因是否差異表達。 結果1ECPs誘導細胞適應性反應模型的建立 用0、0.088、0.88、8.8、88、880、1100、2200、4400、8800μmol/L的H2O2對MRC-5細胞染毒6h，通過MTT法獲得

8、對MRC-5毒性的劑量效應關系，發(fā)現(xiàn)0.088-88μmol/L范圍內(nèi)的H2O2對細胞幾乎沒有損傷(P＞0.05)；從880μmol/L開始，H2O2對細胞有明顯損傷(P＜0.05)。然后進行H2O2對MRC-5時間效應關系的分析，發(fā)現(xiàn)H2O2對細胞染毒1～24h，其毒性沒有顯著的變化(P＞0.05)。所以將0.088、0.88、8.8、88μmol/L作為低劑量，預刺激細胞24h后，然后把1100μmol/L作為高劑量刺激細胞1h。觀

9、察發(fā)現(xiàn)用0.088、0.88、8.8μmol/L的H2O2預刺激細胞后，繼而用1100μmol/L的H2O2攻擊，細胞的損傷明顯較直接用1100μmol/L刺激的損傷輕，而且0.88μmol/L預刺激后這種效果更為明顯，故將0.88μmol/L預刺激細胞24h，1100μmol/L攻擊1h作為H2O2誘導MRC-5適應性反應的模型。 乳酸脫氫酶漏出率(LDH％)的檢測：將細胞按對照組、低劑量組、高劑量組、適應性反應組處理后，檢測

10、LDH漏出率，發(fā)現(xiàn)對照組和低劑量組LDH的漏出率差別很小，統(tǒng)計學上沒有顯著差異(P＞0.05)；而高劑量組LDH的漏出率和對照組比較，顯著增高(P＜0.05)；適應性反應組LDH的漏出率比高劑量組明顯下降，但是還未能夠恢復到對照組的水平。 Annexinv/PI檢測細胞凋亡：同上述處理細胞后檢測凋亡，發(fā)現(xiàn)：低劑量與對照組比較，活細胞數(shù)相對少一些(P＞0.05)，死細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)相對多一些(P＞0.05)；而高劑量組和對照組比

11、較，活細胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)，死細胞數(shù)增多(P＜0.05)，而凋亡細胞數(shù)變化不大(P＞0.05)；適應性反應組的活細胞數(shù)與高劑量組比較有所增多，死細胞數(shù)減少，凋亡細胞數(shù)略有增多。 乳酸脫氫酶漏出率(LDH％)的檢測和Annexinv/PI檢測細胞凋亡的結果都驗證了通過MTT法所獲得的適應性反應的模型。 FA、TCE、HQ的劑量效應關系及適應性反應模型的劑量參照課題組的試驗結果。 2熒光差異顯示PCR尋找差

12、異表達的條帶 以H2O2、FA、TCE、HQ不同處理組的細胞總RNA用特定APs逆轉錄的cDNA為模板，選擇優(yōu)化的APs和ARPs組合，進行熒光差異顯示PCR，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過熒光掃描、定位獲得差異條帶。將低劑量組、高劑量組、適應性反應組與對照組比較：H2O2有60個差異條帶、FA有61個，TCE有52個，HQ有33個。 3差異條帶的再擴增、克隆、鑒定、測序及同源性比較 選擇差異比較明顯的條帶進行

13、二次PCR，然后通過進一步克隆、測序、同源性比較發(fā)現(xiàn)： H2O2的15個再擴增的條帶中，有8個新基因，7個已知基因； FA的11個再擴增的條帶中，有9個新基因，2個已知基因； HQ的8個再擴增的條帶中，有7個新基因，1個已知基因。 4用熒光定量PCR進行差異條帶的驗證 將H2O2部分差異條帶(H8，H18，H21，H30，H34)采用SYBRgreenⅠ熒光染料進行相對定量，目的基因和內(nèi)參的標準曲

14、線表明擴增效率均在90～110％，熔解曲線均為單峰曲線，消除了引物二聚體對結果的影響。實驗結果表明各個片斷表達的差異均和熒光差異顯示PCR結果一致。 結論1本研究采用了傳統(tǒng)差異顯示PCR的改良技術——熒光標記差異顯示PCR法，在引物設計、PCR條件、凝膠濃度、電泳條件以及標記物等方面有所改進，極大地減少了傳統(tǒng)該方法的不足，也大大降低了該方法的假陽性率。 2成功建立了H2O2誘導MRC-5的適應性反應的模型，并通過熒光差異

15、顯示PCR，找到ECPs誘導機體適應性反應過程中差異表達的基因，將這些基因進行克隆，測序，同源性比較，最后通過熒光定量PCR驗證基因表達的差異。 3四種毒物誘導機體適應性反應差異表達基因結果表明低劑量的ECPs誘導適應性反應的機制有以下幾個方面：1)維持細胞穩(wěn)態(tài)的蛋白的參與：如核糖體蛋白S15a、核糖體蛋白S10、LAMP2、MRPL47、凋亡相關轉錄因子1(BCLAF1)；2)抗氧化系統(tǒng)的參與：如SOD1；3)DNA損傷修復系