宮內感染-炎癥后未成熟腦星形細胞膠質化的作用及機制研究.pdf

1、腦白質損傷(White matter damage,WMD)是早產兒最重要的腦損傷,其病理特點主要是腦白質損傷部位出現反應性星形細胞膠質化、小膠質細胞浸潤、少突膠質細胞損傷和髓鞘損害以及軸突損傷等。宮內感染／炎癥、早產和早產兒腦白質密切相關,而且神經膠質細胞和炎癥信號在宮內感染／炎癥導致的腦損傷中起重要作用。宮內感染后腦內炎癥反應影響未成熟星形細胞的增殖和膠質化是腦白質損傷的關鍵之一,Toll-like受體-4(TLR-4)／核因子κB

2、(NF-κB)信號和Notchl／Hes信號可能參與宮內感染／炎癥后未成熟星形細胞的增殖和膠質化機制。本研究通過建立宮內感染的大鼠模型,研究宮內感染／炎癥后未成熟腦星形細胞增殖和膠質化的時空性；以及通過星形細胞培養(yǎng),研究感染／炎癥對未成熟星形細胞增殖和膠質化的影響和TLR-4／NF-κB及Notchl／Hes信號是否參與這一過程；而且予茶多酚(TP-EGCG)干預,探討TP-EGCG對感染／炎癥后未成熟星形細胞增殖和膠質化行為的作用及是

3、否影響星形細胞TLR-4／NF-κB及Notchl／Hes信號等,從炎癥和發(fā)育信號角度進一步說明宮內感染／炎癥后未成熟星形細胞的損傷機制,為將來防治早產兒腦白質損傷提供理論依據。
　　 目的:
　　 研究宮內感染／炎癥后不同時間腦內不同部位(腦室旁白質、海馬、胼胝體和皮層)星形細胞的增殖特點,探討感染／炎癥對未成熟星形細胞增殖和膠質化的影響以及TLR-4、NF-κBp65和細胞因子(TNF-α、IL-1β、MIP-1α、

4、MIP-1β等)的表達特點以及Notch1信號的表達變化,研究TP-EGCG對感染／炎癥后未成熟星形細胞增殖和膠質化行為的作用及這一作用是否影響炎癥信號及Notch1信號。
　　 方法:
　　 1.動物模型:官內感染組孕15天母鼠宮頸左右兩側各注射大腸桿菌稀釋液0.2 mL,對照組注入等量生理鹽水。取新生1、3、7、14、21日齡大鼠腦組織,測定各時點仔鼠體重、腦重,蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組化方法研究新生1、3、

5、7、14、21日齡大鼠腦白質組織病理特點和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達變化。
　　 2.星形細胞培養(yǎng):不同濃度脂多糖(LPS:1μg／mL、5μg／mL、10μg／mL)刺激不同時間(1、3、7天)后,免疫熒光法檢測星形細胞GFAP+／BrdU+的表達變化,觀察星形細胞增殖活性的變化,ELISA法檢測星形細胞培養(yǎng)液細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-10等)濃度變化,同時熒光定量RT-PCR法檢測LPS刺激后星形細胞T

6、LR-4、NF-κB以及細胞因子(TNF-α、IL-1β、MIP-1α、MIP-1β)mRNA的表達變化,以及Notch1、Hes1、Hes5 mRNA的表達變化。
　　 3.TP-EGCG干預:以LPS(5μg／mL)刺激1天和3天,同時予TP-EGCG干預后,免疫熒光法檢測GFAP+／BrdU+表達變化；以及熒光定量RT-PCR法檢測星形細胞TLR-4、NF-κB以及細胞因子(TNF-α、IL-1β、MIP-1α、MIP-1

7、β)mRNA的表達變化和Notch1、Hes1、Hes5 mRNA的表達變化。
　　 結果:
　　 1.宮內感染組子宮及胎盤內血管充血、水腫,并見大量中性粒細胞浸潤,宮內感染組新生1日齡(P1)仔鼠體重和腦重均較同日齡對照組減輕(P<0.05)。宮內感染組與對照組P1和P3大鼠僅腦室旁腦白質區(qū)可見少許GFAP陽性細胞,兩組比較差異無顯著意義(P>0.05)；官內感染組P7大鼠腦室旁白質區(qū)和海馬區(qū)GFAP陽性細胞胞漿明顯、

8、突起增多,細胞數量多于對照組(P<0.05)；官內感染組P14大鼠腦室旁白質、肼胝體和皮層區(qū)GFAP陽性細胞數量多于對照組(P<0.01)；兩組P21大鼠各腦區(qū)GFAP陽性細胞數均無顯著差異(P>0.05)。
　　 2.LPS(10μg／mL)刺激早期GFAP+／BrdU+細胞數與對照組比較減少(P<0.05),而LPS(5μg／mL)刺激后GFAP+／BrdU+細胞數較對照組增加(P<0.05)。LPS(5μg／mL)刺激早期

9、星形細胞培養(yǎng)液TNF-α、IL-1β濃度較對照組升高明顯(P<0.05)。LPS(1μg／mL)刺激1天時星形細胞TLR-4 mRNA表達較對照組降低明顯(P<0.05),而LPS(5μg／mL)刺激3天時星形細胞TLR-4 mRNA表達升高(P<0.05)。LPS(1μg／mL)刺激3天時星形細胞NF-κBp65 mRNA表達減少(P<0.05),而LPS(5μg／mL和10μg／mL)刺激7天時NF-κBp65 mRNA表達均較對照

10、組升高(P<0.05)。LPS(1μg／mL)刺激后星形細胞Notch1 mRNA表達較對照組下降(P<0.05),但LPS(10μg／mL)刺激1天、LPS(5μg／mL)刺激7天時Notch1 mRNA表達升高(P<0.05)。LPS(10μg／mL)刺激1天、LPS(1μg／mL)刺激7天時Hes1 mRNA表達減少(P<0.05),而LPS(1μg／mL)刺激早期星形細胞Hes5 mRNA表達增加與對照組比較有明顯差異(P<0.

11、05)。
　　 3.予TP-EGCG干預后星形細胞GFAP+／BrdU+細胞數較LPS組下降(P<0.05),且與對照組比較差異不明顯(P>0.05)。LPS組與LPS+EGCG組比較星形細胞TLR-4mRNA表達差異無意義(P>0.05),但兩組比較星形細胞NF-κBp65 mRNA表達減少均差異有意義(P<0.05),而兩組比較星形細胞TNF-α、IL-1β、MIP-1α、MIP-1β mRNA表達差異均無意義(P>0.05

12、)。LPS組與LPS+EGCG組星形細胞Notch1、Hes1 mRNA表達差異有意義(P<0.05),但兩組比較星形細胞Hes5 mRNA表達差異無意義(P>0.05)。
　　 結論:
　　 1.官內感染／炎癥后未成熟腦不同腦區(qū)不同日齡的GFAP表達呈一定的時空性,表明宮內感染／炎癥可能改變未成熟腦星形細胞的功能。
　　 2.不同的感染／炎癥條件下對未成熟星形細胞的增殖活性影響是不同的,LPS刺激后星形細胞細胞

13、因子(TNF-α、IL-1β、MIP-1α、MIP-1β、IL-10等)存在短暫的表達增加現象,且不同的感染／炎癥條件下TLR-4／NF-κB及Notch1／Hes信號的表達特點是不同的。
　　 3.TP-EGCG對LPS刺激3天后的星形細胞增殖能力有一定的改變,但對TLR-4 mRNA及細胞因子的表達變化影響不明顯,TP-EGCG對感染／炎癥時星形細胞NF-κBp65 mRNA表達抑制有改善作用,而且TP-EGCG對感染／炎癥