小鼠視網膜多潛能干細胞的分離培養(yǎng)和小鼠胚胎干細胞向視網膜色素上皮細胞定向分化的研究.pdf

1、研究背景：
　　 視網膜色素上皮(Retinal Pigment EPithelium， RPE)具有復雜的結構和特殊的生理機能[1]。RPE能吞噬脫落的光感受器細胞外節(jié)膜盤(rodoutersegmeni， ROS)，這對光感受器細胞外節(jié)的更新及維持正常視覺功能至關重要，其功能障礙會導致嚴重視網膜疾病和一些嚴重的遺傳性變性眼病，如Best病、Stargardt病、Leber先天性黑曚和年齡相關性黃斑變性(age-related

2、 macular degeneration， AMD)等[2]。因此應用RPE細胞移植治療某些眼底疾病是其中的一個研究熱點，目前面臨的主要問題是如何獲得合適的RPE移植細胞，才能在移植后與宿主殘留的視網膜細胞達到最佳的整合效果，以求最大限度地重建患者的視功能。
　　 組織細胞工程尤其是干細胞工程的興起為視網膜損傷的治療提供了一種新的途徑。極小胚胎樣干細胞(very small embryonic-like stem cell，

3、VSEL)是美國路易斯維爾大學Kucia研究小組從小鼠骨髓和人臍帶血中分離出scal＋lin-CD45-、具有類似胚胎干細胞生物特性的的多能干細胞[3]，Liu[4]等從小鼠視網膜神經上皮中分離了相似的視網膜多潛能干細胞(retinal multipotential stem-like cells， retinal PSC)。已有研究證實：這些多潛能干細胞不僅具有與胚胎干細胞相似的形態(tài)學特征和細胞標記物，而且具有胚胎干細胞多分化潛能的特

4、性，在體外可以被誘導分化為內胚層、中胚層、外胚層細胞，潛在分化能力強，若作為組織工程和臨床治療的種子細胞，可避免倫理爭議，具有良好的應用前景。通過免疫磁珠分選的方法，我們從新生小鼠小鼠的神經視網膜組織中得到scal＋lin-CD45-的同一細胞亞群，通過細胞免疫熒光和流式細胞儀檢測其特性，為視網膜移植的供體選擇提供新的來源。
　　 當然，目前最廣泛的種子細胞來源還是胚胎干細胞(Embryonic stem cell， ES)。<

5、br>　　 胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ES)具有無限擴增和多向分化潛能的特點，因此關于其誘導分化的研究成為干細胞研究的熱點。如能在體外將胚胎干細胞(ESCs)源源不斷地誘導分化成患者所需要的靶細胞（如RPE、光感受器細胞細胞），可望突破視網膜移植中面臨的供體來源有限的難題，具有廣闊的應用前景。目前，將ESCs體外誘導分化成RPE細胞的研究已經取得了一定的成果，借鑒皮膚黑色素細胞誘導時采用的ST2細胞層和類似的

6、誘導條件，采用PA6間充質細胞系作為飼養(yǎng)細胞層，小鼠ES細胞能分化為呈六角形排列的、胞漿中出現(xiàn)色素顆粒的RPE細胞，但其誘導效率低[5]。除了共培養(yǎng)[4]或組織移植，目前尚無較好獲得有效RPE的高效率方法。因此，我們設想建立一種無飼細胞層體外培養(yǎng)的小鼠ES誘導成光感受器和RPE的培養(yǎng)體系，提高ES向RPE誘導效率。
　　 目的：
　　 1探討免疫磁珠分選方法從新生C57小鼠視網膜神經上皮中分離出具有多潛能干細胞特性的sc

7、al＋lin-CD45-細胞群的可行性。
　　 2研究小鼠視網膜多潛能干細胞與小鼠胚胎干細胞的形態(tài)特征及基因表達差異。
　　 3探討小鼠視網膜多潛能干細胞向RPE分化的途徑，建立一種無飼細胞層培養(yǎng)的小鼠ES分步誘導成RPE的高效培養(yǎng)體系。
　　 方法：
　　 1小鼠視網膜多潛能干細胞的獲?。喝〕跎?天C57小鼠神經視網膜組織制成單細胞懸液，使用免疫磁珠分選的方法先行Lin-陰性分選后行Scal＋陽性分選得

8、到scal＋lin-CD45-細胞群，使用流式細胞技術和細胞免疫熒光法鑒定其具有極小胚胎樣干細胞的特性。
　　 2小鼠視網膜多潛能干細胞和胚胎干細胞的培養(yǎng)：用小鼠成纖維細胞作為飼細胞層，神經干細胞培養(yǎng)基和胚胎干細胞完全培養(yǎng)基分別培養(yǎng)兩種細胞，并觀察形態(tài)特性。
　　 3小鼠胚胎干細胞和視網膜多潛能干細胞及RPE的鑒定：采用堿性磷酸酶染色(alkaline phosphatase， AKP)進行小鼠ES鑒定，采用免疫組織化學

9、方法檢測小鼠視網膜多潛能干細胞；用Real Time-PCR方法檢測全能性基因Oct4， Nagnog， Sox2在小鼠ES，小鼠視網膜多潛能干細胞與小鼠RPE的表達差異；Reverse Transcription-PCR檢測小眼球相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor， MITF)、酪氨酸酶(Tyrosinase，Tyr)、酪氨酸酶相關蛋白1(tyrosinase r

10、elated protein-1， TRP1)、視網膜色素上皮細胞65蛋白(retinal pigmentepithelial protein-65， RPE65)在小鼠ES，視網膜多潛能干細胞與RPE的表達差異。
　　 4小鼠ES與誘導產生的RPE基因表達差異性檢測：小鼠ES無飼細胞層培養(yǎng)，并添加誘導因子進行26天的誘導方案，采用細胞免疫組織化學方法檢測誘導形成的RPE， Real Time-PCR檢測ES和RPE的Oct4、

11、Nagnog、Sox2基因表達差異，Reverse Transcription-PCR檢測MITF、TYR、TYRP1、RPE65在小鼠ES與RPE的表達差異。
　　 結果v
　　 1小鼠視網膜多潛能干細胞分選率：利用免疫磁珠分選的方法從新生小鼠神經視網膜組織中分離出scal＋lin-CD45-細胞群，細胞計數(shù)分選得率為1.2％。該細胞群干細胞抗原Scal表達率達96.5％，大小為2-6um，形態(tài)呈小圓形，核質比高。

12、r>　　 2小鼠視網膜多潛能干細胞組織形態(tài)學、免疫組化及基因表達：形態(tài)呈小圓形，直徑2到6um，Scal表達陽性；全能性基因Oct4、Nagnog、Sox2的表達比小鼠ES低，比小鼠視網膜色素上皮細胞高，不表達RPE的標記性基因MITF、TYR、TYRP1、RPE65；小鼠ES呈克隆狀生長，排列緊密，細胞集落隆突有立體感，邊緣整齊清晰，形似鳥巢。單個細胞胞漿少，細胞核大，核仁明顯，界限不清。AKP陽性，全能性基因Oct4、Nagnog

13、、Sox2的高表達。
　　 3小鼠ES向RPE的定向誘導：本實驗中尚未從小鼠視網膜多潛能干細胞成功獲得RPE；但小鼠ES無飼細胞層培養(yǎng)并添加誘導因子可定向分化為RPE，獲得的RPE角蛋白表達陽性，Oct4、Nagnog、Sox2不表達，表達RPE的標記性基因MITF、TYR、TYRP1、RPE65。
　　 結論：
　　 1利用免疫磁珠分選的方法可以從新生C57小鼠神經視網膜中成功分離出scal＋lin-CD45-