GnRHa對裸鼠卵巢癌移植瘤模型的化療效果影響及卵巢功能保護的實驗研究.pdf

1、背景：
　　 卵巢癌目前仍是婦科惡性腫瘤中婦女首要的死亡原因。目前卵巢癌的發(fā)病日趨年輕化，且多數(shù)確診時已到晚期。傳統(tǒng)手術(shù)治療、放、化療及生物治療等治療措施療效有限，不良反應(yīng)大，5年生存率徘徊在30％左右。順鉑為目前治療卵巢腫瘤的一線化療藥物。但順鉑不僅對腫瘤細(xì)胞有殺滅作用，同時也對正常的卵巢組織，特別是卵母細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致卵巢功能下降甚至早衰（premature ovarian failure）。文獻報道80％卵巢癌細(xì)胞表達G

2、nRH受體，體外實驗證實，GnRH類似物通過與GnRH受體結(jié)合發(fā)揮直接抑制腫瘤生長和抗增殖作用、誘導(dǎo)凋亡作用。有實驗研究促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin-releasing hormone agonist GnRHa）可能抑制下丘腦-垂體-性腺軸，阻止原始卵泡的募集及進一步發(fā)育成熟，在腫瘤化療過程中有卵巢功能保護的作用。目前甚少有研究關(guān)于卵巢腫瘤化療過程中應(yīng)用GnRHa對化療效果的影響。故通過動物體內(nèi)試驗研究順鉑化療過

3、程中應(yīng)用GnRHa對腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響及是否有卵巢功能保護作用，以尋求既提高卵巢癌患者的生存質(zhì)量又不影響腫瘤化療效果的治療方法，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。
　　 目的：
　　 通過建立裸鼠上皮性卵巢癌移植瘤動物模型，并應(yīng)用順鉑化療及聯(lián)合應(yīng)用 GnRHa（曲普瑞林），探討GnRHa對順鉑化療效果的影響及對卵巢功能保護作用。
　　 （一）構(gòu)建動物模型及探討GnRHa的卵巢功能保護作用
　　 方法：

4、　　 1．人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3在高糖型DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，0.25％胰蛋白酶消化3min，終止反應(yīng)，制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/ml。
　　 2．4只裸鼠進行成瘤預(yù)實驗。在SPF環(huán)境超凈工作臺內(nèi)，以75％酒精消毒腹部皮膚，腹腔接種0.2ml細(xì)胞懸液，觀察兩組動物成瘤情況。
　　 3．觀察1月后取腫瘤組織進行HE染色病理學(xué)檢查及腹腔腫瘤原代培養(yǎng)，確定病理結(jié)果為低分化卵巢漿液

5、性囊腺癌及原代細(xì)胞培養(yǎng)與OVCAR-3一致。再取24只裸鼠隨機分為4組按預(yù)實驗方法進行動物接種，成瘤后遂將24只裸鼠隨機分為4組：即對照組[腹腔注射生理鹽水（NS）0.2ml/w×6w]、順鉑組(第一天腹腔注射NS0.2ml，2周后腹腔注射順鉑5mg/w×4w)、GnRHa+NS組(GnRHa0.3mg皮下注射，2周后NS0.2ml/w腹腔注射×4w)、聯(lián)合用藥組(GnRHa0.3mg皮下注射，2周后順鉑腹腔注射5mg/w×4w)；每組

6、6只。每周稱裸鼠體重。
　　 4．卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察及計數(shù)具有正常結(jié)構(gòu)的原始卵泡及生長卵泡數(shù)。
　　 5．小鼠血清抗苗勒管激素（AMH）ELISA檢測。
　　 結(jié)果：
　　 裸鼠腹腔接種后第10天可觀察到腹部稍膨隆，活動減少，腹腔進針處可見米粒樣大小結(jié)節(jié)，各組體重增長曲線見附圖；打開腹腔，可見腫瘤結(jié)節(jié)分布于腸管、腹膜表面、腸系膜為主，直徑約3-15mm（見附圖）。僅有對照組中1只裸鼠尸解時發(fā)現(xiàn)有淡黃色腹水

7、約0.4ml?？偝闪雎蕿?6％。腹腔腫瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)與OVCAR-3細(xì)胞形態(tài)一致。病理學(xué)檢查結(jié)果：為低分化卵巢漿液性囊腺癌。腫瘤組織呈團塊狀，侵犯脂肪組織及橫紋肌組織；細(xì)胞核核漿比例增大，細(xì)胞漿透明空泡狀，部分紅染；細(xì)胞核呈卵圓或不規(guī)則形，見有核仁，并可見散在凋亡細(xì)胞（圖2、3）。
　　 用藥后對照組裸鼠卵巢形態(tài)正常，順鉑腹腔注射給藥后卵巢組織肉眼觀卵巢組織體積縮小，表面凸凹不平。4組雙側(cè)卵巢重量、卵巢原始卵泡數(shù)及生長卵泡數(shù)

8、見表1。順鉑組卵巢重量明顯降低，與其它三組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組與對照組、GnRHa組兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4組裸鼠卵巢原始卵泡數(shù)、生長卵泡數(shù)分別比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。順鉑組原始卵泡數(shù)、生長卵泡數(shù)明顯少于其余三組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但聯(lián)合用藥組分別與對照組、GnRHa組兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。用藥后，4組裸鼠血清中AMH水平見表1，

9、各組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。順鉑組明顯低于其余三組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但聯(lián)合用藥組分別與對照組、GnRHa組兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 應(yīng)用人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3構(gòu)建裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤的方法簡單易行，4×106/0.2ml即能成瘤，能夠較完整保持了人卵巢漿液性囊腺癌的特點；順鉑對裸鼠卵巢功能具有損害作用；GnRHa不僅對順鉑引起的裸鼠卵巢功能

10、損害具有保護作用，在化療早期還能明顯減少化療引起體重下降的副作用。
　　 （二）探討GnRHa對順鉑化療效果的影響
　　 方法：
　　 1．各用藥組裸鼠腫瘤組織重量及增殖抗原ki67免疫組化評分
　　 2．透射電鏡標(biāo)本制備并觀察腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況
　　 3．腫瘤組織半胱胺酸蛋白酶蛋白-3（Caspase-3）及NFkb檢測
　　 結(jié)果：
　　 1．4組裸鼠腫瘤組織重量及增殖抗原k

11、i67免疫組化評分見表2，4組裸鼠腫瘤組織重量分別比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，順鉑組與聯(lián)合用藥組腫瘤重量明顯低于對照組及GnRHa組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；順鉑組與聯(lián)合用藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；對照組與GnRHa組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2．對照組未發(fā)生凋亡的卵巢癌細(xì)胞細(xì)胞膜，線粒體、細(xì)胞核等細(xì)胞器正常；而在經(jīng)順鉑、GnRHa、GnRHa+順鉑處理后的三組用藥組

12、呈細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核深染，染色質(zhì)濃縮成塊并邊集，其中以早、中、晚期凋亡為最具特征性改變。細(xì)胞凋亡早期：細(xì)胞核染色體發(fā)生邊集,核形不規(guī)整,核膜表面凹凸;凋亡中期：核內(nèi)染色質(zhì)凝聚,趨邊呈月牙狀,核膜孔消失,核膜呈波紋狀皺縮;凋亡晚期：核固縮,細(xì)胞膜出芽形成小泡,可見凋亡小體。
　　 3．三組用藥組，順鉑組、GnRHa+NS組、聯(lián)合用藥組NFkb表達下調(diào)，Caspase-3表達上調(diào)。與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（