SATB1在非小細胞肺癌中表達的初步研究.pdf

1、肺癌（lung cancer）是最常見的惡性腫瘤之一，居全球惡性腫瘤死亡的首位，嚴重威脅著人類的健康和生命。肺癌的病理類型包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩大類，非小細胞肺癌占肺癌總數(shù)的80％～85％，其中大部分是腺癌和鱗癌。肺癌仍然是個高致死性疾病，約一半的病例發(fā)生于發(fā)展中國家。根據(jù)美國國家癌癥研究所進行的監(jiān)測，傳染疾病和最終結(jié)果（SEER）項目所提供的數(shù)據(jù)顯示肺癌5年生存率為15％。大量研究表明，轉(zhuǎn)移是導致肺癌病人病死率高的最主要因素，

2、然而其分子機制并不明確。 研究癌變機制，探索腫瘤發(fā)生發(fā)展過程一直是腫瘤研究的重要課題。1991年，Liotta提出腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移三步驟學說，該過程從分子水平上可以分為三個階段：第一，粘附：腫瘤細胞之間的粘附力下降和腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)之間的粘附；第二，降解：腫瘤細胞和宿主細胞分泌的蛋白水解酶，使腫瘤細胞周圍的細胞外基質(zhì)發(fā)生降解；第三，移動：腫瘤細胞被生長因子及趨化因子誘導，向縱深運動。由此腫瘤細胞可以到達身體的任何部位，錨定、

3、克隆，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)移病灶。Minna通過前瞻性地對肺癌發(fā)生及發(fā)展過程中分子病理學研究，提出一整套基因變異模式，即3P基因丟失→9P基因丟失及ras基因突變→原位癌（p53，17p13．3基因突變）→肺癌侵襲或轉(zhuǎn)移（p15、p16、C-myc、c-erB2、EGFR基因突變）。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，對肺癌的研究進一步深入，普遍認為肺癌發(fā)生發(fā)展存在多步驟、多階段、多途徑，涉及多基因變化、多種分子機制，是一個多因素、綜合調(diào)控的極為復雜的系統(tǒng)變化過

4、程。因此對于肺癌轉(zhuǎn)移機制及相關(guān)因子的研究是目前研究者關(guān)注的熱點。 核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白質(zhì)1-SATB1，是一種組織特異性表達的核基質(zhì)結(jié)合蛋白。它含有兩個CUT基序，可以通過形成類似PDZ結(jié)構(gòu)的二聚體，以非常高的親和力與核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列相結(jié)合。從而影響DNA環(huán)的構(gòu)建，參與了包括染色體重塑、組蛋白乙?；⒓谆冗^程，并與DNaseⅠ超敏感位點具有密切的相關(guān)性。SATB1主要在胸腺細胞中顯著表達，對T細胞的正常發(fā)育具有非常重要的意義

5、，可以協(xié)調(diào)T細胞發(fā)育各個階段的基因正常有序的表達。SATB1參與基因的轉(zhuǎn)錄抑制，SATB1對c-myc癌基因的表達亦產(chǎn)生影響，從而影響到了CD4+和CD8+細胞的成熟。 研究發(fā)現(xiàn)SATB1在乳腺癌進展過程中起到了關(guān)鍵性作用，通過限定多個基因組的位點和補充染色質(zhì)修飾酶來調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因表達。其在惡性程度高的原發(fā)性乳腺癌樣本高表達，而與淋巴結(jié)的狀態(tài)無關(guān)；并發(fā)現(xiàn)SATB1能影響涉及腫瘤發(fā)生的多個方面的1000余個基因的表達，它顯

6、著地改變了乳腺癌細胞的基因表達譜，直接上調(diào)與細胞轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因，同時下調(diào)抑癌基因，誘導其出現(xiàn)侵襲性表型，從而促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。因此，研究者提出SATB1這種核基質(zhì)結(jié)合蛋白擔任了“基因組組織者”的角色的一種新的基因調(diào)節(jié)模式。 采用SYBR GreenⅠ QRT-PCR（quantitatie realtime PCR）技術(shù)對靶基因進行實時熒光定量分析是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)。SYBR GreenⅠ是一種能與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光

7、的熒光染料，使引物設(shè)計較簡單，且成本相對較低。它的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系中存在的雙鏈DNA數(shù)量，對靶基因進行定量分析，準確性和靈敏性都比普通RT-PCR高，并且通過熔解曲線的分析，排除非特異性擴增的干擾。通過2-ΔΔCT方法利用SYBR GreenⅠ QRI-PCR技術(shù)能夠很好的分析基因表達相對差異。用2-ΔΔCT方法分析基因表達相對定量的方法效果確切，由于這種方法無需做標準曲線，因此比絕對

8、定量方法更加簡便可行。實時熒光定量RT-PCR技術(shù)具有檢測范圍寬，敏感性高，精確度高，污染少，產(chǎn)出率高，可以進行多重檢測的顯著優(yōu)越性。其應用范圍涉及到DNA、mRNA和病毒荷載量的定量，核酸多態(tài)性分析，基因突變分析等多個領(lǐng)域。使其在基礎(chǔ)研究和分子學診斷領(lǐng)域受到青睞，是當今研究mRNA表達水平最熱門的技術(shù)之一。 目前國內(nèi)外關(guān)于SATB1研究并不多見，雖然國外有研究表明SATB1在某些惡性腫瘤中有重要價值，直接影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，

9、但對于SATB1與肺癌的關(guān)系尚沒有確切的報道。本實驗擬通過運用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)，以非小細胞肺癌組織和正常肺組織為研究組和對照組，在mRNA水平上檢測各組織SATB1mRNA表達情況，旨在發(fā)現(xiàn)其在不同組織中的表達差異。收集我院2007年9月-2008年9月行手術(shù)切除的肺組織標本，其中非小細胞肺患者42例，包括腺癌29例，鱗狀細胞癌13例；正常組織16例。手術(shù)切下組織后取下標本迅速保存于1 ml RNAlater中，于4℃放置過

10、夜后倒棄保護液，再轉(zhuǎn)移到-196℃液氮保存。應用TRIZOL試劑盒，按說明書要求提取總RNA，再按要求逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以實時熒光定量RT-PCR方法檢測非小細胞肺癌組織及正常組織中SATB1 mRNA的表達。 實驗數(shù)據(jù)應用2-ΔΔCt進行處理，計算各樣本平均CT值和ΔCT值（△Ct=CtSATB1-Ctβ-actin），計算2-ΔΔCt（ΔΔCt：ΔCt目的樣本-△Ct參照樣本），其數(shù)值用于表示目的值相對于參照值的相對倍數(shù)，采

11、用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗及方差分析，P<0．05為差異有顯著性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SATB1mRNA在癌組織中的表達水平比正常組織明顯上調(diào)，表達量為正常組織13．27倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0．01），提示SATB1基因表達與NSCLC的發(fā)病有一定關(guān)聯(lián)性。SATB1mRNA在非小細胞肺癌組織的表達水平在性別、年齡、組織學類型中無統(tǒng)計學差異（P>0．05），表明SATB1基因的表達在非小細胞肺癌

12、中受這些因素的影響不明顯；但與臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)（P<0．01），其中Ⅱ期和Ⅲ期肺癌分別是Ⅰ期肺癌的2．53倍和5．04倍，中分化組和低分化組分別是高分化組2．31倍和4．26倍，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組分別為正常組織23．63倍和5．57倍，提示SATB1基因表達與NSCLC的發(fā)展及侵襲相關(guān)聯(lián)，有望成為非小細胞肺癌預后判斷的指標。 總之，本試驗通過運用實時熒光定量RT-PCR方法檢測非小細胞肺癌及正常