線粒體DNA4834缺失突變在內耳擬老化模型中的作用及其機制研究.pdf

1、實驗一大鼠內耳擬老化伴線粒體突變模型的建立
　　 目的：探討建立大鼠內耳擬老化伴線粒體突變模型，為進一步揭示老年性聾發(fā)病機制及其防治策略奠定基礎。
　　 方法：Wistar大鼠24只，隨機分為2組，A組(D-半乳糖組,14只)，5[％]D-半乳糖頸部皮下注射(150mg*kg-1*d-1)，共8周，繼以生理鹽水腹腔注射10天；B組(空白對照組，10只)全程僅給予生理鹽水注射。聽性腦干反應(auditory brainst

2、em respones，ABR)檢測兩組大鼠反應閾，比色法檢測兩組大鼠膜迷路谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)活力。利用巢氏聚合酶鏈反應技術檢測內耳組織線粒體DNA 4834 bp缺失突變的發(fā)生情況。
　　 結果：用藥后A組大鼠線粒體DNA 4834bp缺失突變發(fā)生率為100[％](28耳/28耳),B組無線粒體DNA 4834 bp缺失突變檢出。A組GSH-PX活力(59.07±

3、2.32U)明顯低于B組(142.10±2.21U)，其差異具有顯著統(tǒng)計學意義(t檢驗，雙側檢驗，P=0.000<0.01)。而A組ABR反應閾平均提高5.36±3.08dB peSPL，B組為6.50±3.37dB peSPL。經(jīng)t檢驗,A組和B組之間差異無顯著性意義(t檢驗，雙側檢驗，pAD=0.508)。
　　 結論：D-半乳糖可以誘導大鼠內耳組織擬老化，此模型大鼠內耳組織線粒體DNA4834bp缺失突變率極高，但是ABR

4、反應閾無明顯提高。
　　 實驗二提取大鼠毛發(fā)核酸3種方法的比較
　　 目的：探討提取大鼠毛發(fā)核酸的方法。
　　 方法：分別用PCR緩沖液法、SDS-蛋白酶K法和Chelex-100法從大鼠毛發(fā)中提取核酸，對所提核酸進行PCR擴增及電泳分析，并對3種方法進行比較。
　　 結果：從毛囊提取mtDNA的成功率，SDS-蛋白酶K法(22.50[％])分別與PCR緩沖液法(64.17[％])和Chelex-100法

5、(67.50[％])比較，差異均有統(tǒng)計學意義(Pc1=42.421，Pc2=28.800,均P<0.001)；PCR緩沖液法與Chelex-100法比較,差異無統(tǒng)計學意義(Pc=0.296,P>0.05)。提取核DNA成功率，SDS-蛋白酶K法(60.00[％])分別與PCR緩沖液法(90.00[％])和Chelex-100法(90.83[％])比較，差異均有統(tǒng)計學意義(Pc1=49.091，Pc2=30.767,均P<0.001)；P

6、CR緩沖液法與Chelex-100法比較，差異無統(tǒng)計學意義(Pc=0.048，P>0.05)。PCR緩沖液法不能從毛干中提取核酸，SDS-蛋白酶K法不能從1、2根鼠毛中提取mtDNA，而Chelex-100法可從毛干和單根鼠毛中提取mtDNA和DNA。
　　 結論：Chelex-100法對從毛發(fā)中提取核酸較為合適。
　　 實驗三大鼠線粒體DNA4834bp缺失突變在不同組織器官中的差異表現(xiàn)
　　 目的：探討在模型

7、大鼠內耳、腎臟、大腦、血、骨骼肌、脾臟、心臟、肝臟、肺和毛發(fā)等不同的組織中，線粒體DNA4834bp缺失突變的發(fā)生情況及其可能的病理意義。同時探討毛發(fā)代替血標本用于臨床檢測線粒體缺失突變的可行性。
　　 方法：Wistar大鼠24只，隨機分為2組，A組(D-半乳糖組,14只)，5[％]D-半乳糖頸部皮下注射(150mg*kg-1*d-1)，共8周，繼以生理鹽水腹腔注射10天；B組(空白對照組，10只)僅給予生理鹽水注射。利用巢氏

8、聚合酶鏈反應技術檢測各組織線粒體DNA 4834 bp 缺失突變的發(fā)生情況。
　　 結果：用藥后A組大鼠各器官均可檢出CD，其中內耳、顳肌、肝臟CD檢出率最高，為100[％]，腎臟和大腦次之，為92.86[％](a)，脾臟85.71[％](b)，心臟、肺臟和毛發(fā)組織為71.43[％]，血液中檢出率最低，僅為35.71[％]。其中除血液CD檢出率與內耳CD檢出率比較，差異具有顯著統(tǒng)計學意義外 (p=0.001<0.01，雙尾檢驗，

9、Fisher's 精確概率檢驗)，其他組織和內耳組織CD檢出率之間的差異無統(tǒng)計學意義(pa=1.000，pb=0.481，pc=0.098，p均>0.05，雙尾檢驗，F(xiàn)isher’s 精確概率檢驗)。而在對照組中，僅肝臟(20[％])，大腦和腎臟(10[％])檢出了CD 突變，其他組織均未檢出CD的存在。
　　 結論：提示D-半乳糖除了誘導大鼠內耳4834bp 缺失突變以外，可以誘導模型多器官CD突變。CD缺失率高低可能與組織的

10、有絲分裂程度和氧化磷酸化活躍程度有關。同時提示毛發(fā)CD檢出率更能代表內耳CD 缺失情況，可以代替血標本用于臨床檢測線粒體缺失突變。
　　 實驗四大鼠內耳擬老化模型對氨基糖貳類抗生素耳毒性的易感性
　　 目的：研究大鼠內耳擬老化模型對氨基糖甙類抗生素的易感性。
　　 方法：Wistar大鼠50 只，隨機分為4組，A組(半乳糖組,14 只)5[％]D-半乳糖頸部皮下注射(150mg.kg-1.d-1)，共8周，繼以生

11、理鹽水腹腔注射10天；B組(半乳糖加卡那霉素組，14只)皮下注射半乳糖同A組，8周后，腹腔注射硫酸卡那霉素(500mg.kg-1.d-1)10天。C組(卡那霉素組，12只)前8周用生理鹽水代替半乳糖，后10天卡那霉素注射同B組。D組(空白對照組，10 只)僅給予生理鹽水注射。聽性腦干反應(auditory brainstemrespones，ABR)檢測各組大鼠反應閾，比色法檢測各組大鼠膜迷路谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione

12、peroxidase,GSH-PX)活力。利用巢氏聚合酶鏈反應技術檢測內耳組織線粒體DNA 4834 bp 缺失突變的發(fā)生情況。
　　 結果：用藥后A組大鼠線粒體DNA4834bp缺失突變發(fā)生率為100[％](28耳/28耳)，B組為92.86[％](26 耳/28 耳)，C組和D組均無線粒體DNA 4834 bp缺失突變檢出。A組GSH-PX活性為59.07±8.70U，B組63.29±12.40U，C組136.67±9.53

13、U，D組142.10±7.02U。A組和D組之間差異具有顯著統(tǒng)計學意義(Pad=0.000)；A組和B組，C組和D組之間差異沒有顯著統(tǒng)計學意義(Pab=0.307，Pcd=0.151)。A組ABR反應閾平均提高5.36±3.08 Db peSPL，B組為61.79±11.20dB peSPL，C組為34.17±4.69 Db peSPL，D組為6.50±3.37 Db peSPL。經(jīng)校正t'檢驗，A組和D組之間差異無顯著性意義(Pad=

14、0.398)，B組和C組分別與D組之間差異有顯著性意義(Pbd=0.000，Pcd=0.000)，B組和C組之間差異也有顯著性意義(Pbc=0.000)。
　　 結論：D-半乳糖可以誘導大鼠內耳組織擬老化，此模型大鼠內耳組織mtDNA4834bp缺失突變率極高，同時對氨基糖甙類抗生素耳毒性的易感性增強。
　　 實驗五核因子與mtDNA4834bp缺失突變相互作用在大鼠內耳對氨基糖貳類藥物耳毒性易感中的作用
　　

15、目的：研究氨基糖甙類抗生素耳聾易感模型中的大鼠內耳膜迷路中線粒體相對拷貝數(shù)，核基因編碼的核呼吸因子-1(NRF-1)、過氧化物酶增值子激活受體-γ亞單位共激活因子(PGC-1)及線粒體DNA編碼的細胞色素C氧化酶亞單位Ⅲ(COXⅢ)的Mrna水平變化，以及COXⅢ蛋白水平的變化和mtDNA4834bp缺失突變，探討核因子與mtDNA4834bp缺失突變相互作用在大鼠內耳對氨基糖甙類藥物易感中的作用。
　　 方法：Wistar大鼠

16、16只，隨機分為2組，A組(半乳糖加卡那霉素組，10只)皮下注射半乳糖同A組，8周后，腹腔注射硫酸卡那霉素(500mg.kg-1.d-1)10天。B組(空白對照組，6只)第一階段用生理鹽水代替半乳糖注射，第二階段用藥同A組。聽性腦干反應(auditory brainstem respones，ABR)檢測各組大鼠反應閾，聚合酶鏈式反應技術(polymerase chain reaction,PCR)檢測內耳線粒體拷貝數(shù)(copy num

17、ber,CN)，巢氏聚合酶鏈反應技術(nest PCR)檢測內耳組織線粒體DNA 4834 bp 缺失突變的發(fā)生情況,半定量的逆轉錄聚合酶鏈反應技術(reverse transcription PCR,RT-PCR)檢測內耳NRF-1、 PGC-1和COXⅢ的Mrna 水平，蛋白免疫印跡法(western-blot)檢測內耳COXⅢ蛋白水平。
　　 結果：用藥后A組大鼠線粒體DNA 4834bp 缺失突變發(fā)生率為100[％]，B