田鼠巴貝斯蟲過氧化物氧化還原酶Prx1和Prx的鑒定及功能分析.pdf

1、最近幾年，田鼠巴貝斯蟲(Babesia microti)已成為一個(gè)新型的人類病原體，也是世界上的許多地區(qū)人類巴貝斯蟲病的主要病原體。蟲體內(nèi)的過氧化物氧化還原酶（Peroxiredoxins，Prxs）是細(xì)胞中一類表達(dá)豐富的蛋白質(zhì)。Prxs蛋白家族和其它抗氧化蛋白酶，如SOD，Gpx，Trx及TrxR一樣在保護(hù)蟲體內(nèi)的生物大分子免受不利因素的影響方面發(fā)揮著重要作用。Prxs還原過氧化氫主要依賴其高度保守的具有氧化還原活性的Cys。Prxs

2、蛋白被劃分為Prx1，Prx5，Prx6，TPX，PrxQ和AhpE六個(gè)亞科，本實(shí)驗(yàn)中研究的是其中的Prx1和PrxQ。雖然這種寄生蟲的Prxs基因組已被測(cè)序和注釋，但其生物性特性尚不清楚。
　　本實(shí)驗(yàn)通過分子生物學(xué)技術(shù)獲得了Prx1和PrxQ全長序列基因，其中Prx1全基因序列長度為594bp，具有一個(gè)編碼194個(gè)氨基酸的開放閱讀框（ORF），該蛋白無信號(hào)肽，利用軟件推測(cè)Prx1的蛋白大小約為23kDa。PrxQ全基因序列長度為

3、537bp，具有一個(gè)編碼194個(gè)氨基酸的ORF，其ORF中有一個(gè)信號(hào)肽序列，利用軟件推測(cè)PrxQ的蛋白大小約為21kDa。我們也成功構(gòu)建了以pET-30a為載體的重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中的原核表達(dá)系統(tǒng)。通過對(duì)誘導(dǎo)條件的摸索，確定在1mM IPTG誘導(dǎo)，200rpm，37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h時(shí)能獲得大量的重組蛋白，并通過Prx1和PrxQ上清進(jìn)一步純化獲得了純度較高的重組蛋白，符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。
　　Prx1和Pr

4、xQ重組蛋白活性分析表明證明Prx1和PrxQ蛋白都有活性，但Prx1蛋白活性更高。在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，PrxQ的序列中有一段信號(hào)肽，可能這決定了Prx1和PrxQ在細(xì)胞中的分布位置不同，從而使兩種蛋白發(fā)揮不同的功能。關(guān)于田鼠巴貝斯蟲各種Prxs的具體作用，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究。另外，通過Western blot鑒定和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFAT）分析證明已經(jīng)成功制備了Prx1和PrxQ多抗血清，同時(shí)Western blot鑒定