人卵透明帶蛋白3突變體的構(gòu)建及其在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、本研究利用重疊延伸PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變技術(shù)對(duì)人卵透明帶3(hZP3)序列中三個(gè)潛在的酵母蛋白水解酶切割位點(diǎn)進(jìn)行突變。通過(guò)消除這些蛋白酶切位點(diǎn)，希望能得到?jīng)]有降解的重組hZP3蛋白。此外，本研究的另一個(gè)目的就是探討hZP3序列中的C端跨膜區(qū)以及作為純化標(biāo)簽的多聚組氨酸在目的蛋白中的位置對(duì)于巴氏畢赤酵母所表達(dá)的重組hZP3蛋白的表達(dá)量和純化過(guò)程的影響。天然hZP3的C端跨膜區(qū)在分泌途徑中已經(jīng)被切除，并沒(méi)有出現(xiàn)在成熟肽中，但是由于這段序列的疏

2、水性，可能會(huì)對(duì)重組蛋白的表達(dá)過(guò)程產(chǎn)生影響。多聚組氨酸標(biāo)簽的作用是為了方便目的蛋白的純化，但它在目的蛋白中的位置可能改變蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響蛋白的表達(dá)和純化。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如下：選用pPIC9K-6×his和pPICZaA作為表達(dá)載體。pPIC9K-6×his是由商品化的表達(dá)載體pPIC9K改造而成，通過(guò)PCR在pPIC9K的SnaBI和EcoRI位點(diǎn)之間插入一段編碼6個(gè)組氨酸和2個(gè)甘氨酸的DNA片斷，使表達(dá)出來(lái)的目的蛋白在N端有6個(gè)串

3、聯(lián)的組氨酸純化標(biāo)簽。根據(jù)C端跨膜區(qū)的有無(wú)和引入酶切位點(diǎn)的不同，通過(guò)重疊延伸PCR構(gòu)建4個(gè)hZP3基因突變體。經(jīng)過(guò)酶切和連接，將突變的hZP3基因片斷分別克隆到載體pPIC9K-6×his和pPICZaA中。4個(gè)重組質(zhì)粒經(jīng)SacI線性化處理后轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115中表達(dá)重組hZP3蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot鑒定分析，結(jié)果表明：(1)通過(guò)定點(diǎn)誘變消除潛在蛋白酶切位點(diǎn)成功抑制了表達(dá)產(chǎn)物的降解；(2)C—端跨膜