四種染色體檢測技術(shù)在產(chǎn)前診斷臨床應(yīng)用研究.pdf

1、染色體異常是與遺傳相關(guān)最常見的出生缺陷。由于染色體是基因的載體，因而染色體發(fā)生異常，將會導(dǎo)致基因增加或缺失，從而出現(xiàn)智力低下、多種器官、組織畸形，表現(xiàn)出多種癥狀和體征，它是造成出生缺陷的主要原因之一。影響嚴重的是迄今為止，尚無有效治療方法。唯一有效措施是在孕期及早發(fā)現(xiàn)，及早處理，避免此類患者出生。
　　 染色體異常分為數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常。胎兒常見的染色體異常發(fā)生在21，18，13號常染色體和性染色體X、Y的非整倍體異常，該類異常

2、占活產(chǎn)兒染色體異常的95％，臨床主要表現(xiàn)為21-三體綜合征(DownSyndrome，DS)，18-三體綜合征（EdwardSyndrome），13-三體綜合征（PatauSyndrome），45，X(TurnerSyndrome)，47，XXY(KlinefelterSyndrome)等。在所有染色體異常中，DS是最常見染色體異常，沒有產(chǎn)前診斷和治療性流產(chǎn)干預(yù)的情況下，其出生率約為1.5‰。眾所周知，DS是一種中度～重度智力低下，機體

3、功能缺陷，器官多發(fā)畸形等的綜合癥候群，先天性心臟病患兒中有15～50％是DS。至今尚無有效的治療方法，DS的醫(yī)療看護、康復(fù)、特殊教育與培訓(xùn)是個漫長的過程，需要有大量的投入，而且絕大多數(shù)病人喪失工作能力，只能被動地依靠社會、家庭的撫養(yǎng)。它給家庭和社會帶來巨大痛苦和負擔(dān)。
　　 由于染色體異常無法治療，因而孕期通過產(chǎn)前診斷，阻止異常的胎兒出生是降低染色體異常出生缺陷率的有效措施。產(chǎn)前診斷如果發(fā)生錯誤會導(dǎo)致患兒出生或正常胎兒流產(chǎn)，造成

4、嚴重后果。所以應(yīng)用于產(chǎn)前診斷的檢測技術(shù)要求技術(shù)成熟、診斷準確率高，最大程度避免誤診和漏診。20世紀70年代，首例羊水細胞培養(yǎng)、核型分析的成功，實現(xiàn)了在妊娠中期對染色體異常胎兒做出明確診斷，標志著產(chǎn)前診斷技術(shù)的建立。幾十年來，傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)技術(shù)曾是檢測染色體異常的唯一方法。近十余年，隨著各種分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，很多新的染色體異常診斷技術(shù)開始發(fā)展和成熟。目前，用于產(chǎn)前診斷染色體異常的檢測技術(shù)主要有3類技術(shù)，一是細胞遺傳學(xué)技術(shù)即核型分

5、析;二是快速染色體異常檢測(rapidaneuploidydetection，RAD)技術(shù)，主要有熒光原位雜交技術(shù)（fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）和定量熒光多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)(quantitativefluorescencepolymerasechainreaction，QF-PCR);三是分子核型技術(shù)即微陣列比較基因組雜交技術(shù)(array-basedcomparativegenomichybr

6、idization，array-CGHoraCGH)。由于任何一種檢測技術(shù)都不可能完全診斷染色體異常，面對眾多的檢測技術(shù)，如何兼顧效益和檢出率選擇合適的檢測技術(shù)用于產(chǎn)前診斷，關(guān)鍵是充分研究和了解各種染色體檢測技術(shù)的局限性。
　　 核型分析技術(shù)是非常成熟的技術(shù)，一直以來都是診斷染色體異常的金標準。它需要通過細胞培養(yǎng)后，再進行核型分析。產(chǎn)前診斷的絨毛、羊水細胞有兩種培養(yǎng)方法:原位法和培養(yǎng)瓶兩種方法。原位培養(yǎng)方法培養(yǎng)時間短，成功率高，

7、對細胞培養(yǎng)中的嵌合問題容易判斷。培養(yǎng)瓶法現(xiàn)在國際上已摒棄不用，絕大多數(shù)實驗室都使用原位細胞培養(yǎng)方法。大多數(shù)使用平皿蓋玻片的原位細胞培養(yǎng)方法，操作繁瑣，對技術(shù)要求高，因此在國內(nèi)尚未推廣應(yīng)用。很多國內(nèi)實驗室還是使用培養(yǎng)瓶法進行細胞培養(yǎng)。為解決此問題，需要找到一種操作簡單、容易掌握、培養(yǎng)時間短的原位培養(yǎng)方法，來推廣此培養(yǎng)技術(shù)在國內(nèi)的應(yīng)用，從而保證產(chǎn)前診斷的準確性。
　　 盡管核型分析是診斷染色體異常的金標準，但由于細胞培養(yǎng)時間長，診斷

8、周期長，一般需要2、3周，給孕婦及家屬帶來很大的精神壓力。而且在細胞培養(yǎng)過程中，可能污染等原因?qū)е屡囵B(yǎng)失敗，或受分裂相數(shù)量、質(zhì)量、顯帶技術(shù)及操作人員技能的影響導(dǎo)致分析失敗。且染色體核型分析分辨率低，對＜5M的片段的缺失和重復(fù)等無法檢測。因此還需要發(fā)展其他的產(chǎn)前診斷技術(shù)來彌補核型分析報告時間過長和分辨率不高的不足。
　　 以熒光原位雜交技術(shù)、定量熒光多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)的分子細胞遺傳技術(shù)為代表的快速染色體異常檢測（rapidaneup

9、loidydetection，RAD）。實現(xiàn)了在1～3天內(nèi)診斷包括DS在內(nèi)的常見染色體數(shù)目異常，顯著縮短了報告時間。它對常見21，18，13號常染色體和性染色體X、Y的非整倍體異常檢測的靈敏度和特異度已為許多大規(guī)模的研究證實。盡管RAD無法對所有染色體進行檢測，但是在診斷常見的染色體異常方面如DS等，他們可與傳統(tǒng)的核型分析技術(shù)相媲美，且方法簡單、容易操作。并且它們的分辨率高于核型分析技術(shù)，可以檢測3M左右已知位點的染色體微結(jié)構(gòu)異常，是核

10、型分析技術(shù)的有力補充。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)院(AmericanCollegeofMedical)對RAD技術(shù)評價，為“相對成熟的技術(shù)、在某種程度上是和常規(guī)染色體分析作用相同的技術(shù)”。2004年，英國國家篩查委員會（UKNationalScreeningCommittee，UKNSC）宣布對于DS篩查高風(fēng)險孕婦可以不采用核型分析的方法，直接通過FISH或QF-PCR確診胎兒是否有DS。各國對于RAD技術(shù)的選擇有所不同，歐洲廣泛應(yīng)用QF-PCR

11、技術(shù)，而在美國、澳大利亞應(yīng)用FISH技術(shù)較多。盡管RAD技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但在我國產(chǎn)前診斷臨床應(yīng)用領(lǐng)域并不普及，只有少數(shù)大的產(chǎn)前診斷中心逐步開始在臨床應(yīng)用。主要有3個問題未解決，一是RAD技術(shù)診斷的敏感性和特異性是否可以被接受;二是檢測費用高，如何降低價格;三是，RDA是否可以作為一種診斷方法單獨應(yīng)用于胎兒染色體異常的產(chǎn)前診斷或如何應(yīng)用于臨床。我國對RAD技術(shù)的研究缺乏大樣本臨床資料，且相關(guān)這方面評價研究報道也非常少。因此需要針對這3個

12、問題，評價RAD技術(shù)在國內(nèi)產(chǎn)前診斷的臨床應(yīng)用效果，降低檢測價格，評估FISH和QF-PCR這兩種技術(shù)的區(qū)別，哪種技術(shù)更適合國內(nèi)實驗室發(fā)展，評估是否能夠用RAD技術(shù)取代傳統(tǒng)核型分析技術(shù)。
　　 盡管RAD彌補了核型分析的一些不足，但RAD只能檢測已知位點的染色體異常。而臨床上相當(dāng)一部分染色體不平衡畸變患者的染色體組或者基因組大多發(fā)生了未知的細微不平衡改變，核型檢測技術(shù)和分子細胞遺傳技術(shù)均無法檢測。1998年研發(fā)出array-CGH

13、技術(shù)，為解決這個問題提供了技術(shù)平臺。它不僅分辨率高，且無需制備中期染色體，僅需1μg的DNA量，一次實驗即可檢測全基因組DNA拷貝數(shù)的變化，耗時僅72小時。能夠可靠地檢測出所有因染色體微缺失或微重復(fù)引起的基因組不平衡畸變，定位精確，清楚顯示畸變片段內(nèi)的基因含量，對發(fā)現(xiàn)、鑒定疾病相關(guān)基因有重要意義。
　　 盡管該技術(shù)對染色體異常診斷價值很高，近年來逐步應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，成為熱點技術(shù)，但國內(nèi)將該技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷臨床的報道非常少。其原

14、因是由于該方法不能檢測沒有發(fā)生基因拷貝數(shù)增減的染色體平衡畸變（平衡易位和平衡倒位）、多倍體和20％以下的嵌合體。由于分辨率過高，會檢測出大量良性和不明臨床意義的拷貝數(shù)變異（copynumbervariation，CNV），給孕婦及其家屬帶來不必要的焦慮，甚至擔(dān)心胎兒的健康而終止妊娠。而且ArrayCGH的檢測費用比常規(guī)染色體核型分析昂貴。對于這種非常有價值技術(shù)該如何應(yīng)用才能發(fā)揮它的優(yōu)越性，幫助診斷胎兒的染色體異常，是國內(nèi)產(chǎn)前診斷領(lǐng)域需要

15、解決的問題。
　　 本課題目的是通過細胞核型分析、快速染色體異常檢測以及array-CGH技術(shù)，三類4種染色體檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用研究，綜合評價各種技術(shù)的應(yīng)用范圍，為國內(nèi)醫(yī)療機構(gòu)了解和開展產(chǎn)前診斷檢測技術(shù)提供一個參考。
　　 第一部分新型原位培養(yǎng)方法在產(chǎn)前診斷臨床應(yīng)用
　　 目的:
　　 建立一種操作簡單、培養(yǎng)時間短、容易掌握的新型原位培養(yǎng)方法，便于在國內(nèi)產(chǎn)前診斷推廣應(yīng)用。
　　 方法:
　　

16、 1.實驗分組:2009年1月～3月在我院產(chǎn)前診斷中心行羊膜腔穿刺術(shù)的118例孕婦，孕16周～23周之間，沒有手術(shù)禁忌癥者。抽取的羊水配對分為兩組分別進行培養(yǎng)，實驗組為新型原位培養(yǎng)瓶法，對照組為傳統(tǒng)平皿蓋玻片法。
　　 2.標本接種:羊膜腔穿刺抽取21ml羊水，每組8ml配對分組，實驗組接種到1個原位培養(yǎng)瓶，對照組接種到3個dish中的蓋玻片上分別進行培養(yǎng)，其余5ml接種于T型培養(yǎng)瓶作為備份培養(yǎng)。
　　 3.核型分析:

17、按常規(guī)培養(yǎng)、收獲、制片和顯帶，進行核型分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.培養(yǎng)成功率:118例樣本，實驗組和對照組方法進行羊水培養(yǎng)，均培養(yǎng)成功。
　　 2.培養(yǎng)時間:實驗組培養(yǎng)時間和對照組相比較明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.細胞克隆和中期核型分裂相:培養(yǎng)后細胞克隆數(shù)，實驗組只用一個培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)，獲得的細胞克隆數(shù)仍多于對照組使用3個平皿進行培養(yǎng)獲得的細胞克隆數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜

18、0.05)。收獲后獲得的滿意染色體核型分裂相實驗組多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)
　　 結(jié)論:
　　 與傳統(tǒng)平皿蓋玻片比較，新型原位培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)時間短、核分裂相多、傳代率低，操作簡單，適于在國內(nèi)臨床推廣應(yīng)用。
　　 第二部分快速染色體檢測(RAD)技術(shù)在產(chǎn)前診斷臨床應(yīng)用
　　 目的:
　　 研究FISH和QF-PCR兩種技術(shù)在產(chǎn)前診斷的大樣本臨床應(yīng)用結(jié)果，比較兩種技術(shù)的優(yōu)缺點，綜合評

19、估RAD技術(shù)臨床應(yīng)用的可行性。
　　 方法:
　　 1.隨機選擇1955例產(chǎn)前診斷樣本:絨毛10例、羊水1036例用FISH進行檢測;絨毛15例、羊水894例用QF-PCR進行檢測，均以核型分析作為結(jié)果驗證。
　　 2.優(yōu)化FISH技術(shù)以降低檢測成本應(yīng)用于絨毛、羊水樣本的快速檢測。
　　 3.選取13、18、21、X、Y關(guān)鍵區(qū)域STR位點合成23對探針分兩管擴增，建立QF-PCR多重PCR技術(shù)，同時檢測常

20、見5種染色體異常。
　　 4.按照國際通用的對診斷技術(shù)評價的層次框架模式，從技術(shù)效能，診斷效能，效益評價，對RAD進行綜合評估，獲得該技術(shù)合適的國內(nèi)產(chǎn)前診斷臨床應(yīng)用方案。
　　 結(jié)果:
　　 1.對1955例樣本進行核型分析后，發(fā)現(xiàn)正常核型1892例，異常核型62例，其中數(shù)目異常40例，結(jié)構(gòu)異常19例，嵌合體3例。
　　 2.FISH檢測1046例樣本，成功率99.90％(1045/1046)，絕對敏感性

21、96％(24/25)，絕對特異性100％(1021/1021)
　　 3.改進雜交的處理過程，將探針雜交液的用量減為常規(guī)用量的1/4即2.5μL，探針雜交效率沒有受到影響，探針雜交信號清晰。
　　 4.QF-PCR檢測909例樣本，成功率99.89％(908/909)，絕對敏感性93.75％(15/16)，絕對特異性100％(892/892)
　　 5.設(shè)計23對探針進行多重PCR擴增，擴增效率沒有受到到影響，達

22、99.78％。
　　 6.在RAD的5種染色體檢測范圍內(nèi)，共檢出39例異常，與核型分析一致的符合率99.90％，漏診2例。
　　 7.在核型分析檢出的所有染色體異常，RAD漏診了23例，其中8例為有臨床意義染色體異常，漏診率0.4％(8/1955)。
　　 結(jié)論:
　　 1.優(yōu)化FISH實驗操作，提高雜交效率，可以達到減少探針雜交液用量，減少試劑成本，降低檢測費用
　　 2.選擇的23個STR位點

23、特異性高，多重擴增效率高，對5種染色體異常診斷效率高
　　 3.FISH和QF-PCR兩種RAD技術(shù)診斷5種染色體異常的靈敏度和特異度無顯著性差異，由于FISH檢測設(shè)備相對QF-PCR的設(shè)備價格低，而且有商業(yè)化的試劑盒對技術(shù)要求相對低，因此在一些病例數(shù)不多且沒有開展分子診斷技術(shù)的中心，開展FISH檢測有較高的可行性。
　　 4.從檢測范圍(21，13，18，X，Y)的特異度和敏感度而言，RAD和核型分析在檢測染色體異常方

24、面沒有顯著差別。
　　 5.RAD技術(shù)對于超聲正常、單純唐氏高?；蚴窃袐D高齡的病例可以考慮用RAD檢測部分代替核型分析的應(yīng)用方案。
　　 第三部分array-CGH技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用
　　 目的:
　　 建立array-CGH技術(shù)平臺，探討array-CGH技術(shù)在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用價值和應(yīng)用方案。
　　 方法:
　　 1.孕周在17～34周，34例產(chǎn)前診斷病例，1例羊水，33例臍血。羊

25、水病例是由于胎死宮內(nèi)，羊水培養(yǎng)不成功，無法行核型分析。4例臍血是羊水染色體檢查發(fā)現(xiàn)可疑染色體不平衡易位。其余29例臍血是超聲發(fā)現(xiàn)胎兒發(fā)育異常。
　　 2.33例臍血按常規(guī)進行細胞培養(yǎng)、G顯帶染色體核型分析。有異常結(jié)果，同時檢測父母染色體核型。
　　 3.按OligoCGHMicroarray芯片的標準操作常規(guī)對34例病例進行檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1.本研究成功對34個樣本進行了array-CGH技術(shù)

26、分析，發(fā)現(xiàn)了7例異常。
　　 2.病例1:G顯帶染色體核型結(jié)果為衍生X染色體，但無法確定條帶[46，X，der(X)?t(X;?Y)(q12;q11)]。父母染色體核型正常。行array-CGH分析顯示X染色體長臂發(fā)生了66Mb缺失，46，X，del(X)(q21.31-q28)
　　 3.病例2:G顯帶染色體核型分析初步結(jié)果為9號染色體短臂插入部分片段，無法確定條帶[46，XN，ins(9;？)(p12;?)]。母親為

27、相同9號染色體。行array-CGH分析實驗結(jié)果提示胎兒微陣列結(jié)果未見異常。
　　 4.病例3:G顯帶染色體核型分析考慮為10號染色體長臂插入了部分片段，本院臍血檢查G顯帶染色體核型分析結(jié)果相同，但無法明確片段來源[46，XX，ins(10;？)(q22;?)]。父母染色體核型正常。array-CGH分析結(jié)果提示10號染色體長臂發(fā)生了22.5Mbp的重復(fù)，46，XN，dup(10)(q21.2-q23.1)。
　　 5.

28、病例4:G顯帶染色體核型分析，可疑18號染色體長臂部分缺失，但未確定斷裂點，以及缺失片段是否有易位到其他染色體上[46，XN，del(8)(p11?)]。父親染色體核型7號和18號染色體平衡易位，無法確定胎兒是否與父親的易位一致。array-CGH分析，清楚顯示7號染色體長臂發(fā)生了11.2Mbp的重復(fù)，18號染色體短臂發(fā)生了14Mbp的缺失，不平衡易位，46,XY,dup(7)(q36.1-q36.3),del(18)(p11.32-p

29、11.21)
　　 6.病例5:因胎兒發(fā)育異常，要求行羊水檢查，穿刺術(shù)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎死宮內(nèi)，擔(dān)心羊水細胞培養(yǎng)的成功率低，同時行array-CGH檢測。G顯帶核型45，X。arrayCGH結(jié)果提示胎兒為X單體;同時發(fā)現(xiàn)在9號染色體長臂有11Mbp的重復(fù)，45，X，dup(9)(q34.11-q34.3)
　　 7.病例6-34均因胎兒發(fā)育異常行核型分析和arrayCGH。病例6:G顯帶核型46，XN，der(14)(q1

30、2?)。array-CGH結(jié)果提示14號染色體長臂同時發(fā)生了重復(fù)和缺失，重復(fù)片段有30.7Mb，缺失片段有2.3Mb;病例7G顯帶核型47，XN，+13，array-CGH結(jié)果提示13號染色體整體片段發(fā)生重復(fù)，重復(fù)片段有96Mb，為13三體;病例8G顯帶核型47，XN，+21，array-CGH結(jié)果提示21號染色體整體片段發(fā)生重復(fù)，重復(fù)片段有33Mb，為21三體。病例9-34，G顯帶核型和array-CGH未發(fā)現(xiàn)異常。
　　 結(jié)

31、論:
　　 1.Array-CGH技術(shù)是一種全新的分子核型分析技術(shù)，其分辨率和準確性極高，有效地克服或彌補了現(xiàn)有的染色體診斷技術(shù)的局限性。
　　 2.Array-CGH技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷中不平衡染色體病和胎兒發(fā)育異常的檢測，可快速、準確地在分子水平上明確診斷，為產(chǎn)前診斷醫(yī)生進行遺傳咨詢析提供科學(xué)依據(jù)，有利于準確評估胎兒預(yù)后和指導(dǎo)妊娠結(jié)局。
　　 3.對于Array-CGH技術(shù)檢測得到的結(jié)果，需要進行相應(yīng)的生物信息