利用脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)膜片構(gòu)建組織工程化兔角膜基質(zhì).pdf

1、目的: 探討氯化鈉法及冰凍切片法制備脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)膜片的可行性，并進(jìn)一步復(fù)合兔角膜基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)，探討脫細(xì)胞角膜基質(zhì)膜片在兔角膜基質(zhì)缺損中的修復(fù)效果，為角膜基質(zhì)的組織工程修復(fù)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法: 將去除上皮層和內(nèi)皮層的全層豬角膜基質(zhì)瓣采用氯化鈉法脫細(xì)胞，組織學(xué)檢測(cè)脫細(xì)胞效率，冰凍切片法將脫凈細(xì)胞的厚基質(zhì)瓣切成20μm厚度的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)膜片，紫外線照射滅菌保存。采用組織塊法分離培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞，傳至第三

2、代作為構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)的種子細(xì)胞。將培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞以三明治法接種于脫細(xì)胞角膜基質(zhì)膜片支架，層層疊加6層膜片形成支架-細(xì)胞復(fù)合物，體外培養(yǎng)2周后組織學(xué)檢測(cè)組織形成狀態(tài)。構(gòu)建兔角膜基質(zhì)缺損模型，將膜片和基質(zhì)細(xì)胞按照三明治法移植至角膜基質(zhì)缺損部位，共疊加5層膜片，另設(shè)單純?nèi)睋p不修復(fù)組、厚基質(zhì)移植組(100μm)、單純膜片無(wú)細(xì)胞組（5層）為對(duì)照組，術(shù)后第1月，3月和6月進(jìn)行大體拍照觀察、眼前節(jié)光學(xué)相干斷層掃描、超聲角膜測(cè)厚、角膜透光度

3、檢測(cè)、生物力學(xué)檢測(cè)、組織學(xué)檢查、透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察等，評(píng)價(jià)治療效果。
　　結(jié)果: 氯化鈉法能有效脫除豬角膜基質(zhì)中的角膜基質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)能良好地維持基質(zhì)膠原纖維的形態(tài)和排列，在脫細(xì)胞基質(zhì)的基礎(chǔ)上制作脫細(xì)胞基質(zhì)膜片簡(jiǎn)單易行。組織塊法培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞體外生長(zhǎng)良好，細(xì)胞接種至脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)膜片支架材料上增殖良好，掃描電鏡檢測(cè)顯示細(xì)胞在膜片上貼附生長(zhǎng)良好。體外構(gòu)建組織分層明顯，細(xì)胞存活但基質(zhì)分泌少。兔角膜基質(zhì)移植修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，單純?nèi)睋p不

4、修復(fù)組角膜菲薄，局部白色瘢痕及新生血管長(zhǎng)入;厚基質(zhì)移植組透明度尚可，瞳孔區(qū)可見(jiàn)云翳，隨時(shí)間的延長(zhǎng)云翳略減淡;單純膜片無(wú)細(xì)胞組無(wú)明顯瘢痕，但可見(jiàn)少量膜片皺褶，角膜欠透明，呈斑翳形態(tài);脫細(xì)胞基質(zhì)膜片接種角膜細(xì)胞組3個(gè)月時(shí)可見(jiàn)縫線周圍新生血管生成，6個(gè)月時(shí)逐漸減退，角膜透明。眼前節(jié)光學(xué)相干斷層掃描顯示單純?nèi)睋p組基質(zhì)信號(hào)不均，有高信號(hào)區(qū)的疤痕組織;厚膜片組可見(jiàn)移植膜片與原基質(zhì)間有明顯的界限，融合欠佳;單純膜片組角膜基質(zhì)層信號(hào)欠均勻，可見(jiàn)裂隙狀低

5、信號(hào)區(qū)，表明膜片間粘合欠佳;膜片加細(xì)胞組基質(zhì)信號(hào)較均勻，移植膜片間融合良好。厚度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單純?nèi)睋p組最薄，其次為單純脫細(xì)胞基質(zhì)膜片移植組，脫細(xì)胞基質(zhì)移植組和膜片加細(xì)胞移植組的厚度均與正常組接近。脫細(xì)胞基質(zhì)膜片加角膜細(xì)胞移植組在各波長(zhǎng)可見(jiàn)光下的透光率與正常角膜最為接近。與正常對(duì)照組相比，單純?nèi)睋p組的生物力學(xué)檢測(cè)值均最低，而脫細(xì)胞膜片加細(xì)胞移植組術(shù)后6個(gè)月的最大荷載，抗拉強(qiáng)度和彈性模量均與正常組十分接近。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)單純?nèi)睋p組的角膜厚度顯著

6、變薄，雖然厚基質(zhì)移植組，及單純基質(zhì)膜片移植組的厚度有所增加，但未見(jiàn)細(xì)胞分布，而膜片加細(xì)胞移植組見(jiàn)細(xì)胞均勻分布。透射電鏡檢測(cè)中，膜片加細(xì)胞移植組的膠原纖維直徑與正常組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。
　　結(jié)論: 氯化鈉法加冰凍切片法制作脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)膜片簡(jiǎn)單易行。脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)膜片用組織塊法培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞在脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)膜片支架上生長(zhǎng)良好，采用膜片與接種細(xì)胞疊加的方法能使角膜基質(zhì)細(xì)胞較均勻地分布在基質(zhì)層中，利于新生角膜基質(zhì)的生成和修