自噬對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞放療敏感性影響機(jī)制的初步探討.pdf

1、研究背景:放射治療是肺癌最重要的治療手段之一，然而卻因放療抵抗極易導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和殘留。腫瘤的放療敏感性主要與DNA損傷修復(fù)能力有關(guān)。研究表明，放療可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬發(fā)生，最新研究也報(bào)道，自噬可能與DNA損傷修復(fù)過(guò)程相關(guān)，但通過(guò)調(diào)控自噬可否影響DNA損傷修復(fù)，增加肺癌細(xì)胞放療敏感性尚不清楚。
　　研究目的:本課題旨在研究自噬活化劑雷帕霉素上調(diào)A549細(xì)胞自噬水平后對(duì)放療敏感性的影響及其分子機(jī)制。
　　研究方法:以人腺癌A54

2、9細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組(N)、單純放療組(IR)、雷帕霉素聯(lián)合放療組(R+RAPA)。①采用MTT法檢測(cè)雷帕霉素對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，并計(jì)算生長(zhǎng)抑制率≤10％的濃度(IC10)②R組予0-12Gy射線(xiàn)照射，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，并計(jì)算IC50值。③R組及R+RAPA(IC10)予4Gy射線(xiàn)照射，采用Real-time PCR檢測(cè)Rad51 mRNA、Ku70/Ku80 mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)

3、γ-H2AX蛋白、Rad51蛋白、Ku70/80蛋白、p62蛋白、LC3蛋白表達(dá);電鏡檢測(cè)自噬體形成;細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SF4值。
　　研究結(jié)果:
　?、俨煌瑵舛壤着撩顾貙?duì)A549細(xì)胞增殖的影響。
　　在10nmol/L-120nmol/L雷帕霉素干預(yù)濃度區(qū)間，A549細(xì)胞抑制率逐漸增高，且呈劑量依賴(lài)性(p＜0.05)。雷帕霉素作用后24h IC10=18.4nmol/L。
　　②雷帕霉素調(diào)控自噬影響A549細(xì)

4、胞放療敏感性。
　　細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在0-12Gy實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，放療射線(xiàn)對(duì)A549細(xì)胞具有殺傷作用，IC50=4.194Gy。單純放療組及放療聯(lián)合雷帕霉素組SF4分別為62.11±3.56％和32.44±2.18％。
　　電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，放療及雷帕霉素均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬體形成增加，與單純放療組相比，雷帕霉素聯(lián)合放療組自噬體增加更顯著。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，單純放療組及放療聯(lián)合雷帕霉素組LC

5、3Ⅰ減少，LC3Ⅱ增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加，p62減少;與單純放療組相比，放療聯(lián)合雷帕霉素組LC3Ⅰ減少，LC3Ⅱ增加，LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加，p62減少(p＜0.05)。表明通過(guò)上調(diào)A549細(xì)胞自噬，可增加放療敏感性。
　　③雷帕霉素調(diào)控自噬影響放療敏感性的機(jī)制。
　　與對(duì)照組相比，放療后1h，放療組及放療聯(lián)合雷帕霉素組γ-H2AX表達(dá)增加(p＜0.05)，兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與放療后1h相比，放療后24h放療組及

6、放療聯(lián)合雷帕霉素組γ-H2AX蛋白表達(dá)減少;放療后24h，與放療組相比，放療聯(lián)合雷帕霉素組γ-H2AX蛋白表達(dá)增加(p＜0.05)。表明放療可引起A549細(xì)胞DSBs損傷，采用Rapamcin上調(diào)A549細(xì)胞自噬水平，可使A549細(xì)胞DSBs損傷持續(xù)存在。
　　與對(duì)照組相比，放療組Rad51蛋白表達(dá)增加(p＜0.05)，Ku70蛋白、Ku80蛋白無(wú)明顯變化，放療聯(lián)合雷帕霉素組Rad51蛋白、Ku80蛋白減少(p＜0.05)，Ku7

7、0無(wú)明顯變化;與放療組相比，放療聯(lián)合雷帕霉素組Rad51、Ku80蛋白減少(p＜0.05)，Ku70無(wú)明顯變化。表明采用Rapmycin上調(diào)A549細(xì)胞自噬水平，可通過(guò)抑制放療后Rad51蛋白、Ku80蛋白表達(dá)，減少DSBs修復(fù)。
　　與對(duì)照組相比，單純放療組Rad51 mRNA于2h、4h增加(p＜0.05)，Ku70mRNA、Ku80 mRNA無(wú)明顯變化;與對(duì)照組相比，放療聯(lián)合雷帕霉素組Rad51mRNA于2h、4h增加(p＜

8、0.05)，Ku70 mRNA、Ku80 mRNA變化不明顯;放療組與放療聯(lián)合雷帕霉素組之間Rad51 mRNA、Ku70 mRNA、Ku80 mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明放療可誘導(dǎo)Rad51 mRNA表達(dá)上調(diào)，而對(duì)Ku70 mRNA、Ku80 mRNA無(wú)明顯影響，采用Rapamycin上調(diào)A549細(xì)胞自噬，并未影響放療后DSBs修復(fù)相關(guān)分子mRNA表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　①雷帕霉素可抑制A549細(xì)胞存活，并呈劑量依賴(lài)性。