新型豬膠原基真皮支架細(xì)胞毒性及與細(xì)胞相容性的實驗研究.pdf

1、目的: 通過對一種新型的豬膠原基真皮支架(PCDM)的組織超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察并對其細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測，為這種新型生物材料的實驗及臨床安全應(yīng)用提供依據(jù)。通過將體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞種植到豬膠原基真皮支架乳頭層和網(wǎng)狀層面上，觀察人成纖維細(xì)胞在不同層面的黏附和生長特點，探討改良異種真皮替代物，提高其細(xì)胞相容性的方法。 方法: 1)通過HE、免疫組織化學(xué)染色和掃描電鏡觀察豬膠原基真皮支架的組織結(jié)構(gòu)并與異體脫細(xì)胞真皮(HADM

2、)和豬脫細(xì)胞真皮(PADM)的組織結(jié)構(gòu)相比較。 2)制取不同濃度的PCDM浸提液，設(shè)陽性對照，陰性對照與空白對照，以L-929細(xì)胞為檢測細(xì)胞。繪制不同接種濃度時本實驗室L-929細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)生長曲線，確定合適的細(xì)胞接種濃度，用MTT法檢測真皮支架不同濃度的浸提液對細(xì)胞增殖的影響情況，按醫(yī)用生物材料細(xì)胞毒性分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評級。 3)應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行人成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)。 4)用MTT法測定種植24小時后人成纖維

3、細(xì)胞在PCDM乳頭層面的黏附情況，并與空白培養(yǎng)板對照，確定細(xì)胞在支架上的種植密度。 5)將PCDM真皮乳頭層面和真皮網(wǎng)狀層面分別朝上鋪于培養(yǎng)板上，接種人成纖維細(xì)胞，于接種后1、7、14天通過HE染色，掃描和透射電鏡觀察成纖維細(xì)胞在其不同層面上的分布增殖狀況和形態(tài)及功能狀態(tài)。 結(jié)果: 1)組織學(xué)觀察：光鏡下PCDM表皮已完全去除，真皮內(nèi)未見細(xì)胞成分、血管、毛囊和皮脂腺等皮膚附件，膠原基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)保持完整。乳頭層面

4、光滑完整，免疫組織化學(xué)染色見上有一層極薄線形的棕黃色的染區(qū)，提示基底膜完整，其下為與基底膜平行、規(guī)則排列的膠原纖維，乳頭層膠原排列相對致密；網(wǎng)狀層表面較粗糙，可見斷裂的膠原纖維的殘端，膠原束較乳頭層粗大、疏松。掃描電鏡顯示PADM和PCDM的膠原纖維排列致密有序，結(jié)構(gòu)與HADM極為類似，但豬真皮的膠原纖維較人真皮排列更為緊密，提示豬真皮內(nèi)的膠原纖維含量大于人真皮內(nèi)的膠原纖維含量。橫斷面掃描電鏡顯示：PCDM膠原束排列比PADM疏松類似于

5、HADM。 2)在接種細(xì)胞數(shù)量定為5×10<'3>/孔和1×10<'4>/孔時，一周內(nèi)L929生長曲線可以看出細(xì)胞量與代謝增殖率間呈正直線相關(guān)，細(xì)胞活力佳，測量所得數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定，最適宜進(jìn)行PCDM細(xì)胞毒性的測定。采用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞毒性檢測方法檢測PCDM，其細(xì)胞增殖度與空白對照及陰性對照無顯著性差異，明顯優(yōu)于陽性對照組，細(xì)胞毒級評分為0～1，可認(rèn)為PCDM無明顯的細(xì)胞毒性。 3)FB在PCDM上的黏附數(shù)目明顯低于在培養(yǎng)板上的

6、黏附數(shù)，在PCDM上的黏附數(shù)目相當(dāng)于在培養(yǎng)板上的50﹪。 4)HE染色顯示：FB接種于PCDMl天時，A組較B組有更多的樣本見到散在的FB的粘附，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；7天時，A組較B組有更多的樣本見單層的線形排列的FB細(xì)胞膜片，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，未見FB長入真皮基質(zhì)內(nèi)，A組和B組均有樣本見到FB呈復(fù)層生長，層與層之間細(xì)胞連接較松散，B組有6/25個樣本見細(xì)胞長入真皮基質(zhì)內(nèi)；14天時，A組有18/27

7、的樣本無FB粘附，而B組僅有9/30的樣本無細(xì)胞生長，并見更多的真皮基質(zhì)內(nèi)有FB長入，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<4.01)。掃描電鏡觀察：3天時在乳頭層和網(wǎng)狀層均可見到星形的FB伸出偽足緊貼于PCDM表面，部分區(qū)域見平行排列的梭形的FB通過長長的突起連接，7天時見FB呈梭形密布于PCDM乳頭層表面，功能活躍的FB胞膜及附近有纖細(xì)的膠原原纖維交織成網(wǎng)狀。透射電鏡下見PCDM兩面上成纖維細(xì)胞功能活躍，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體豐富，高爾基復(fù)合體發(fā)

8、達(dá)，核仁明顯，核染色質(zhì)呈大小不等的顆粒狀。 結(jié)論: 1)經(jīng)過多種物理化學(xué)方法處理的這種豬膠原基真皮支架是一種無毒、安全的新型的天然異種真皮支架。 2)人成纖維細(xì)胞在豬膠原基真皮支架上增殖良好，部分樣本可見細(xì)胞遷入支架內(nèi)部，說明豬膠原基真皮支架具有較好的細(xì)胞相容性，不存在異種抗原阻礙人成纖維細(xì)胞的遷入，可能是膠原結(jié)構(gòu)方面的缺陷使細(xì)胞不能廣泛遷入，提示進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改良有助于提高其細(xì)胞相容性。 3)在細(xì)胞種植的